柳香香,孫達(dá)權(quán),許鍵煒，范海瓊,徐國強(qiáng),潘際剛

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程實(shí)驗(yàn)中心，貴州 貴陽 550004；3. 黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥技術(shù)系，貴州 凱里 556000)

砷及其化合物具有毒性，在我國一些地區(qū)嚴(yán)重超標(biāo)，經(jīng)人體攝入后，易引起急、慢性砷中毒，造成肝臟、心臟、腎臟或皮膚等器官或組織損傷[1]。研究顯示，神經(jīng)細(xì)胞難以再生，且對(duì)毒性物質(zhì)更加敏感，因而砷暴露時(shí)間過長將損傷神經(jīng)系統(tǒng)[2-3]。因此，如何有效預(yù)防和治療砷中毒顯得尤為重要。3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，MPST或3-MST)由297個(gè)氨基酸組成，定位于細(xì)胞質(zhì)。MPST以單體或二硫鍵連接的同型二聚體存在，其功能是催化硫離子的轉(zhuǎn)移，使硫離子結(jié)合硫醇化合物(如氰化物)，進(jìn)而參與氰化物解毒和半胱氨酸降解[4]。本課題組前期研究顯示，亞砷酸鈉(sodium arsenite，NaAsO2)可抑制PC-12和SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞生長，下調(diào)MPST蛋白表達(dá)[5-6]。因此，本研究采用SH-SY5Y細(xì)胞為研究對(duì)象，外源性過表達(dá)MPST蛋白，觀察其在NaAsO2干預(yù)神經(jīng)細(xì)胞生長周期中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，購自德國DSMZ公司。

1.1.2試劑 胎牛血清(FBS)，購自杭州四季青公司；青霉素-鏈霉素和胰蛋白酶，購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)和結(jié)晶紫染液，購自北京索萊寶公司；DMEM培養(yǎng)基，購自美國HyClone公司；NaAsO2，購自美國Sigma公司；CCK-8溶液，購自日本同仁；PI單染細(xì)胞周期檢測試劑盒，購自南京凱基；抑癌基因p53蛋白抗體、細(xì)胞周期調(diào)控因子CDC25A抗體、細(xì)胞周期蛋白A(cell cycle protein A，CyclinA)抗體、周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinases 2，CDK2)抗體、MPST抗體、抗小鼠IgG-HRP二抗，購自美國Santa Cruz公司。

1.1.3儀器 Model 310細(xì)胞恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)(蘇州凈化)；全波段多功能酶標(biāo)儀(BioTek公司)；Eclipse Ti-s倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；全自動(dòng)凝膠成像儀(美國SynGene)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素)中，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，隔天換液，細(xì)胞生長至70%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代或凍存。

1.2.2慢病毒轉(zhuǎn)染MPST過表達(dá) 經(jīng)PCR擴(kuò)增、雙酶切、連接目的片段與載體、挑選陽性克隆、測序驗(yàn)證，擴(kuò)增培養(yǎng)陽性菌落，而后鑒定和抽提質(zhì)粒。慢病毒包裝MPST質(zhì)粒和空載體，收集病毒并測定滴度。SH-SY5Y細(xì)胞在12孔板生長至50%匯合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞更換為含10 mg·L-1基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑聚凝胺(polybrene)及10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，分別于不同孔加入1 mL含MPST和空載體的病毒液，分別設(shè)為過表達(dá)組和空載對(duì)照組，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，更換含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞生長至90%匯合度時(shí)，以嘌呤霉素進(jìn)行篩選，最終以蛋白印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MPST表達(dá)水平。

1.2.3組別設(shè)置 實(shí)驗(yàn)組別分別為：慢病毒轉(zhuǎn)染的過表達(dá)組(overexpression group)，簡稱OP組；空載對(duì)照組(no-load control group)，簡稱NC組；同時(shí)以正常模型細(xì)胞設(shè)立空白組(blank control group)，簡稱BC組。

1.2.4CCK-8法檢測 取對(duì)數(shù)期模型細(xì)胞，以每孔8×103個(gè)鋪于96孔板中，培養(yǎng)過夜，設(shè)6個(gè)NaAsO2濃度梯度(5、10、20、50、75、100 μmol·L-1)，每組5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔。放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，酶標(biāo)儀測定OD值(450 nm)，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=[(NaAsO2處理孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-調(diào)零孔OD值)]×100%。

取對(duì)數(shù)期BC、NC和OP組細(xì)胞，分別以每孔8×103個(gè)鋪于96孔板中，培養(yǎng)過夜，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，以含50 μmol·L-1NaAsO2的DMEM培養(yǎng)基處理上述3組細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔及以BC細(xì)胞設(shè)置空白對(duì)照組，48 h后按上述方法繼續(xù)操作。

1.2.5結(jié)晶紫染色 選擇對(duì)數(shù)期BC、NC和OP組細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)至匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)，細(xì)胞同步化12 h，然后以含50 μmol·L-1NaAsO2的DMEM培養(yǎng)基處理上述3組細(xì)胞，繼續(xù)無血清培養(yǎng)。24 h后結(jié)晶紫染色，細(xì)胞PBS洗3遍，每孔2 mL 4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗掉固定液后，雙蒸水洗2遍，每遍1 min，加入2 mL結(jié)晶紫染色10 min，雙蒸水洗滌后拍照，每組取拍照?qǐng)D3～5張，人工計(jì)數(shù)后進(jìn)行圖片和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。設(shè)BC組細(xì)胞貼壁存活率為100%，細(xì)胞貼壁存活率=(NaAsO2處理組細(xì)胞數(shù)/BC組細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.6細(xì)胞周期檢測 取對(duì)數(shù)期BC、NC和OP組細(xì)胞鋪于6孔板中(5×109·L-1)，培養(yǎng)過夜，以含50 μmol·L-1NaAsO2的DMEM培養(yǎng)基處理上述3組細(xì)胞，同時(shí)以無NaAsO2的DMEM培養(yǎng)BC細(xì)胞作為空白對(duì)照，48 h后以不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，1 528×g離心5 min，PBS洗2次，70%乙醇于4 ℃ 冰箱固定30 min，1 528×g離心5 min，PBS洗2次，1 528×g離心5 min，棄PBS，加入300 μL PI/RNase染色工作液，室溫避光60 min，加入樣品管中，用流式細(xì)胞儀在488 nm激發(fā)光處檢測。

1.2.7蛋白印跡檢測 藥物處理細(xì)胞后，以RIPA細(xì)胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF)裂解細(xì)胞，冰上裂解10 min，20 627×g離心15 min，取上清液進(jìn)行BCA蛋白定量，計(jì)算并配制上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h，用p53、CDC25A、CyclinA、CDK2抗體(1 ∶1 000)或內(nèi)參抗體GAPDH(1 ∶2 000)于4 ℃搖床孵育過夜，PBS洗膜3次，抗小鼠IgG-HRP二抗室溫孵育1 h，PBS洗膜3次，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像儀成像，以Quantity One對(duì)蛋白印跡條帶處理和分析。

2 結(jié)果

2.1 NaAsO2和MPST對(duì)細(xì)胞活力的影響如Fig 1B所示，NaAsO2(5、10、20、50、75、100 μmol·L-1)分別處理模型細(xì)胞24、48 h，48 h時(shí)NaAsO2對(duì)模型細(xì)胞的IC50為50 μmol·L-1。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(Fig 1A)，BC和NC組MPST蛋白表達(dá)無明顯差異；而與NC組相比，OP組MPST蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。以NaAsO2(50 μmol·L-1)處理3組細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示(Fig 1C)，BC和NC組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)；BC和NC組間細(xì)胞存活率無明顯差異；而與NC組相比，OP組細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.01)。

2.2 NaAsO2和MPST對(duì)細(xì)胞貼壁能力的影響如Fig 2所示，NaAsO2(50 μmol·L-1)處理48 h，BC和NC組細(xì)胞貼壁力明顯降低(P<0.01)，BC和NC組細(xì)胞貼壁存活率無明顯差異；與NC組相比，OP組細(xì)胞貼壁存活率明顯回升(P<0.01)。

2.3 NaAsO2和MPST對(duì)細(xì)胞周期的影響如Fig 3、Tab 1所示，NC加藥組和BC加藥組細(xì)胞周期無明顯差異，與空白組相比，給予NaAsO2(50 μmol·L-1)處理48h后，BC和NC組細(xì)胞S期比例明顯增加(P<0.01)；而與NC組相比，OP組細(xì)胞S期比例明顯減少(P<0.05)。

Fig 1 Effects of NaAsO2 and MPST over-expressionon cell viability of SH-SY5Y

A：MPST protein expression level；B：Effects of different concentrations of NaAsO2on the viability of model cells；C：Effect of NaAsO2on the viability of cells in each group.**P<0.01vsNC；##P<0.01vsBC alone.

2.4 NaAsO2和MPST對(duì)蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，NaAsO2(50 μmol·L-1)處理48 h， BC和NC組細(xì)胞p53蛋白明顯上調(diào)，CDC25A、CyclinA及CDK2蛋白明顯下調(diào)(P<0.01)；BC和NC組細(xì)胞各蛋白表達(dá)無明顯差異；與NC組相比，OP組細(xì)胞上述改變明顯被拮抗(P<0.05,P<0.01)。

Fig 2 Effect of MPST over-expression on cell adherenceviability of NaAsO2 inhibition

A：Effect of NaAsO2on the viability of adherent cells in each group；B：Adherence survival rate.**P<0.01vsNC；##P<0.01vsBC alone.

Tab 1 Effects of NaAsO2 and MPST over-expression on cell cycle in all group

##P<0.01vsBC;*P<0.05vsNC+NaAsO2

3 討論

環(huán)境中的砷一般以無機(jī)砷化物的形式存在，如NaAsO2、三氧化二砷、砷酸鹽等，長期暴露于無機(jī)砷化物環(huán)境中可引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷、心血管疾病、泌尿系統(tǒng)等疾病[7]。砷進(jìn)入血液后可通過血腦屏障進(jìn)入大腦，進(jìn)而損傷神經(jīng)系統(tǒng)。研究表明[8]，NaAsO2可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞骨架形成，破壞細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)。

前期工作表明[5]，NaAsO2可抑制SH-SY5Y細(xì)胞生長。而本研究發(fā)現(xiàn)，MPST過表達(dá)能明顯抑制NaAsO2導(dǎo)致的細(xì)胞活力和貼壁能力下降的效應(yīng)。

Fig3Cellcyclechangesineachgroup

A：BC group；B：OP group；C：Treatment of BC group with NaAsO2；D：Treatment of NC group with NaAsO2；E：Treatment of OP group with NaAsO2.

Fig 4 Changes of p53,CDC25A,CyclinA and CDK2 protein expression in different

*P<0.05，**P<0.01vsNC；##P<0.01vsBC alone

有報(bào)道，NaAsO2或三氧化二砷能誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞G2/M期阻滯、生長抑制[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)，NaAsO2明顯誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞S期阻滯，而過表達(dá)MPST可減輕NaAsO2對(duì)S期的阻滯效應(yīng)。這些結(jié)果提示，MPST過表達(dá)所發(fā)揮的保護(hù)效應(yīng)可能與降低細(xì)胞S期阻滯有關(guān)。

為了探討MPST對(duì)細(xì)胞S期相關(guān)蛋白的影響，我們進(jìn)一步觀察了p53、CDC25A、CyclinA及CDK2等S期相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)NaAsO2處理后，SH-SY5Y細(xì)胞CyclinA、CDK2及CDC25A明顯下調(diào)，p53明顯上調(diào)；而過表達(dá)MPST可拮抗NaAsO2對(duì)CyclinA、CDK2、CDC25A及p53的作用。

CyclinA-CDK2是細(xì)胞S期主要的復(fù)合物，能啟動(dòng)DNA的復(fù)制[10-11]。據(jù)報(bào)道，阿霉素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2 S期阻滯，伴隨CyclinA、CDK2及CDC25A表達(dá)下調(diào)[12]。有研究報(bào)道，miR-155可通過上調(diào)p53蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞周期阻滯[13]。在本研究中，NaAsO2可能通過上調(diào)p53，下調(diào)CyclinA、CDK2、CDC25A蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞S期阻滯；過表達(dá)MPST通過調(diào)節(jié)S期相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)揮對(duì)NaAsO2毒性損傷的拮抗效應(yīng)。

硫化氫對(duì)化學(xué)性神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，而MPST是硫化氫的內(nèi)源性合成酶[4，14]。因此，外源性過表達(dá)MPST增加了內(nèi)源性硫化氫，進(jìn)一步拮抗砷造成的細(xì)胞S期阻滯，從而發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)將為臨床神經(jīng)性砷中毒的防治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在貴州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室實(shí)驗(yàn)室完成，感謝所有老師和同學(xué)對(duì)本課題研究給予悉心指導(dǎo)和幫助。)