張潔 金華 古麗米熱·布然江 李小文 姚麗艷

[摘要] 目的 研究缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（Glut-1）在宮頸癌組織中的表達情況及其臨床意義。 方法 選取2015年1月～2017年12月新疆醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院宮頸手術切除樣本的石蠟切片，采用免疫組化方法檢測87例宮頸癌組織（宮頸癌組）、75例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織（宮頸上皮內(nèi)瘤變組）及69例旁癌正常組織（癌旁正常組）中HIF-1α和Glut-1的蛋白表達情況，分析其表達與臨床病理資料的關系。采用Spearman分析宮頸癌組中兩蛋白的相關性。 結(jié)果 宮頸癌組中HIF-1α的陽性率為79.31%（69/87），顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組[13.33%（10/75）]和癌旁正常組[5.80%（4/69）]（P < 0.01）;Glut-1在宮頸癌組中的陽性率為66.67%（58/87），顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組[24.00%（18/75）]和旁癌正常癌組[20.29%（14/69）]（P < 0.01）;宮頸癌組中HIF-1α和Glut-1表達呈正相關（r = 0.644，P < 0.05），且兩蛋白表達與肌層浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、及FIGO分期相關（P < 0.05），而與年齡、宮頸癌腫瘤的大小、組織學分級、病理類型無關（P > 0.05）。 結(jié)論 HIF-1α和Glut-1在宮頸癌組織中表達顯著升高，是診斷宮頸癌、提示疾病進展的潛在生物學標志。

[關鍵詞] 宮頸癌;缺氧誘導因子-1α;葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1;診斷;疾病進展

[中圖分類號] R737.33? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（c）-0086-04

[Abstract] Objective To explore the expression and clinical significance of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） and glucose transporter-1 （Glut-1） in cervical carcinoma tissues. Methods From January 2015 to December 2017， the Third School of Clinical Medicine， Xinjiang Medical University， paraffin sections of cervical resection samples were randomly selected. The HIF-1α and Glut-1 expression of 87 cases of cervical carcinoma tissues （cervical carcinoma group）， 75 cases of cervical intraepithelial neoplasia tissues （cervical intraepithelial neoplasia group） and 69 cases of cervical epithetium tissues （cervical epithetium group） was detected by immunohistochemical method， the relationship between the expression and the clinicopathological data was analyzed. Spearman test was used to analyze the correlation between the two proteins in cervical cancer tissues. Results The positive rate of HIF-1α in cervical carcinoma group （79.01%， 69/87） was significantly higher than that in cervical intraepithelial neoplasia group （13.33%， 10/75） and cervical epithetium group （5.80%， 4/69） （P < 0.01）; the positive rate of Glut-1 in cervical carcinoma group （66.67%， 58/87） was significantly higher than that in cervical intraepithelial neoplasia group （24.00%， 18/75） （P < 0.01） and cervical epithetium group （20.29%， 14/69） （P < 0.01）; the expression of HIF-1α was positively related with Glut-1 （r = 0.644， P < 0.05）， and their expression was related with myometrial infiltration depth， lymph node metastasis and FIGO date （P < 0.05）， but they were not related with age， cancer size， histological grades and tumor pathological types （P > 0.05）. Conclusion The expression of HIF-1 and Glut-1 increased significantly in cervical carcinoma tissues， which is the potential biomarker of cervical cancer diagnosis and disease progression indication.

[Key words] Cervical carcinoma; Hypoxia-inducible factor-1α; Glucose transporter-1; Diagnosis; Disease progression

宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中排第二位，全球每年死亡人數(shù)約為50萬人，我國每年宮頸癌新發(fā)病數(shù)超過13.15萬人[1]。目前宮頸癌的發(fā)病機制并不十分清楚，有學者認為其發(fā)病機制與宮頸細胞增殖活躍后的低氧應激關系密切[2-3]。低氧是腫瘤發(fā)生的微環(huán)境基礎，缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）能夠在缺氧條件下促進下游能量供應鏈中的多種蛋白表達的特異轉(zhuǎn)錄因子。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（glucose transporter 1，Glut-1）是HIF-1α的下游靶基因之一，在細胞內(nèi)葡萄糖酵解過程中發(fā)揮重要作用。以往報道HIF-1α和Glut-1參與多種惡性腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移[4-6]，但其在宮頸癌中的作用還需要深入探究。因此，本研究探索HIF-1α和Glut-1蛋白在宮頸癌組織中的表達情況，分析其與臨床病理特征的關聯(lián)，為宮頸癌的診斷提供潛在生物學標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月～2017年12月新疆醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院宮頸手術切除樣本的石蠟切片，根據(jù)病理診斷結(jié)果分為三組，宮頸癌組87例患者，年齡45～60歲，平均（52.12±7.48）歲;根據(jù)國際婦產(chǎn)聯(lián)合會（the International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期標準[3]，宮頸癌組臨床分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期24例，Ⅲ期20例，Ⅳ期27例;病理分型鱗癌49例，腺癌38例。宮頸上皮內(nèi)瘤變組75例患者，年齡44～58歲，平均（51.56±6.89）歲;FIGO臨床分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期21，Ⅲ期17例，Ⅳ期24例;病理類型鱗癌40例，腺癌35例。癌旁正常宮頸組69例患者，年齡47～59歲，平均（54.32±5.41）歲。三組研究樣本來源者的年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者和/或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

納入標準：①臨床病理醫(yī)師經(jīng)病理組織活檢確診為宮頸癌;②臨床病理醫(yī)師經(jīng)病理組織活檢確診為宮頸上皮內(nèi)瘤變組織來源者無合并其他惡性腫瘤;③正常宮頸組織來源于距離癌組織3 cm的癌旁組織;④所有標本來源者近1個月無感染性疾病;⑤所有標本來源者近1個月未接受藥物治療。排除標準：①標本來源者存在其他疾病或感染;②宮頸癌診斷不明確者;③臨床病例資料不完整。

1.2 方法

所有標本切成4 μm薄片層，68℃烤片2 h，二甲苯浸泡后，用梨酸鹽緩沖液清洗后，加入3%過氧化氫，EDTA進行抗原修補。封閉后，加入HIF-1α或Glut-1一抗稀釋液（1∶200）（北京中杉金橋公司）4℃過夜，37℃復溫1 h;滴加二抗經(jīng)4℃孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺顯色2 min，蘇木精復染30 s，梯度乙醇脫水、透明后封片鏡檢。

1.3 觀察指標及評價標準

三位臨床病理醫(yī)師從陽性細胞率及著色情況兩個方面進行雙盲判讀，至少兩人判讀結(jié)果相同。HIF-1α和Glut-1表達分別位于細胞膜、細胞核。隨機選擇5個高倍視野，每個視野計數(shù)200個瘤細胞，計數(shù)每個視野中陽性細胞數(shù)及總細胞數(shù)，計算出陽性細胞率。0分：0≤細胞陽性率≤5%;1分：5%<細胞陽性率≤25%;2分：25%<細胞陽性率≤50%;3分：50%<細胞陽性率≤75%;4分：細胞陽性率>75%。根據(jù)兩種蛋白著色情況，分為：0分為無色，1分為淡黃色，2分為中黃色，3分為褐色?？傇u分=陽性細胞率評分×著色評分，0～1分為（-）、2～4分為（+）、5～6分為（++）、7分及以上為（+++）。（-）為陰性;（+～+++）為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗。采用Spearman進行相關性分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α和Glut-1蛋白在不同宮頸組織中的免疫組化結(jié)果

HIF-1α主要表達于細胞核和/或細胞漿，陽性染色呈棕黃色細顆粒狀。宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤組織中HIF-1α蛋白陽性表達增加，而癌旁正常組織中無HIF-1α表達。

Glut-1主要表達于癌細胞胞膜和/或紅細胞。在癌組織中，陽性染色呈灶狀或彌散分布，深淺不等，遠離間質(zhì)血管或臨近壞死區(qū)的癌細胞染色加深。Glut-1蛋白在宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤組織中的陽性表達均增加，而癌旁正常組織中不表達或微弱表達。

2.2 HIF-1α和Glut-1在不同宮頸組織中的表達情況

HIF-1α在宮頸癌組中的陽性表達率顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組和癌旁正常組（P < 0.01），HIF-1α在宮頸上皮內(nèi)瘤變組和癌旁正常組中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;Glut-1在宮頸癌組中的陽性表達率顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組和癌旁正常組（P < 0.01），Glut-1在宮頸上皮內(nèi)瘤變組和癌旁正常組中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 宮頸癌組HIF-1α和Glut-1表達與臨床病理特征的相關性

宮頸癌組中HIF-1α和Glut-1的表達與年齡、腫瘤大小、組織學分型、腫瘤病理類型無關（P > 0.05），而與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肌層浸潤程度均有關（P < 0.05）。見表2。

2.4 宮頸癌組HIF-1α和Glut-1表達的相關性

Spearman進行相關性分析顯示，宮頸癌組HIF-1α和Glut-1的表達呈正相關（r = 0.644，P = 0.013）。

3 討論

宮頸癌發(fā)病率和死亡率逐年攀升[1]，嚴重危害人類健康，因此了解宮頸癌的早期診斷、檢測腫瘤的疾病進展至關重要。目前宮頸癌的致病機制還不完全清楚，以往報道認為，腫瘤組織中的氧化應激（reactive oxygen species，ROS）在腫瘤的形成與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4]。腫瘤細胞內(nèi)的有氧環(huán)境失衡，細胞的缺氧狀態(tài)刺激腫瘤細胞快速增殖并形成實質(zhì)性腫瘤團塊，導致團塊周圍血管阻塞[7]。部分血管失去正常的血運功能，加重腫瘤周圍的低氧狀態(tài)。為了對抗低氧環(huán)境，腫瘤細胞通過活化多種細胞存活信號通路，以適應低氧環(huán)境，維持自身生長繁殖。HIF-1是一種異型低氧轉(zhuǎn)錄誘導因子，由HIF-1α和HIF-1β構(gòu)成，在腫瘤細胞適應低氧環(huán)境中發(fā)揮重要作用[5]。低氧環(huán)境中，HIF-1α能活化下游涉及葡萄糖代謝、細胞增殖等100多個基因的轉(zhuǎn)錄。研究顯示，HIF-1α在肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等腫瘤組織中表達升高，并在腫瘤的形成與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[6]。例如，HIF-1α抑制抗凋亡基因（如c-Myc、survivin）的表達、誘導原癌基因（如Bax、caspase 3/8）的表達從而抑制肺癌細胞及胃癌細胞凋亡;HIF-1α是低氧誘導的自噬的核心調(diào)節(jié)因子，幫助細胞應答低氧和代謝壓力，產(chǎn)生ATP而使細胞避免壞死及凋亡性死亡，促進腫瘤細胞在細胞毒性壓力下的存活[7]，使結(jié)腸癌細胞對放射治療的敏感性降低[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過免疫組化分析顯示，HIF-1α在宮頸癌組織中的陽性率顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組和癌旁正常組，提示HIF-1α蛋白的異常表達可能參與了宮頸癌的形成過程，HIF-1α高表達可以通過影響宮頸癌上皮細胞的持續(xù)性誘導分化調(diào)控因子α的活性，促進局部癌細胞相關蛋白信號通路途徑等的異常激活，加劇宮頸癌的發(fā)生風險[9]。

GLUTs是葡萄糖轉(zhuǎn)運入腫瘤細胞的關鍵酶，維持多個生物過程的能量供應[10]。Glut1是GLUTs的經(jīng)典成員之一，在正常上皮細胞及癌旁上皮細胞中幾乎不表達[11]。有文獻報道在非小細胞肺癌、結(jié)腸癌、胃癌等腫瘤組織中Glut1表達上調(diào)，增加腫瘤細胞內(nèi)葡萄糖的水平，參與腫瘤形成、侵襲與轉(zhuǎn)移[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，Glut1在宮頸癌組織中高表達，在宮頸癌組織中的陽性率顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組和癌旁正常組。同時Glut1表達量與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肌層浸潤程度相關，提示Glut1與腫瘤的形成密切相關，這與以往報道類似[15-16]。Glut1是HIF-1α下游靶基因之一，受到HIF-1α的靶向調(diào)控[17]。在快速生長的腫瘤組織中，HIF-1通過誘導糖酵解通路中的關鍵酶而過表達Glut1，幫助低氧腫瘤細胞轉(zhuǎn)換葡萄糖代謝類型，達到誘導糖酵解的目的。Huang等[18]報道，HIF-1α既能通過調(diào)節(jié)Glut1增加非線粒體途徑ATP的產(chǎn)生，又能結(jié)合在PDK3的啟動子，誘導其表達，削弱線粒體呼吸鏈而增加糖酵解，表明HIF-1α-Glut1通路在腫瘤細胞糖酵解過程中至關重要。本研究還發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中HIF-1α與Glut1的表達呈正相關，提示HIF-1α-Glut1在宮頸癌細胞中的能量供應中發(fā)揮重要作用，提示HIF-1α可能是調(diào)節(jié)宮頸癌細胞內(nèi)Glut1葡萄糖轉(zhuǎn)運膜蛋白的主要途徑，持續(xù)低氧狀態(tài)促進了HIF-1α的表達，進而誘發(fā)宮頸癌的生長與浸潤。除HIF-1α之外，Glut1葡萄糖供應的調(diào)節(jié)通路還包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、Ras、c-Myc和P53等，說明Glut1葡萄糖代謝轉(zhuǎn)換功能受到多個信號通路的調(diào)節(jié)，據(jù)此推測可能存在其他Glut1調(diào)節(jié)基因，與HIF-1α共同調(diào)控Glut1的葡萄糖轉(zhuǎn)換功能[19-20]。

綜上所述，宮頸癌組HIF-1α和Glut-1表達均有明顯升高，且兩者表達水平與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肌層浸潤程度相關，提示HIF-1α、Glut1促進腫瘤細胞的代謝及存活，與宮頸癌的形成和侵襲相關。此外HIF-1α和Glut1在宮頸癌組織中表達呈正相關，可以聯(lián)合應用于宮頸癌的診斷和疾病進展的評估。因此，HIF-1α和Glut1在宮頸組織中的表達對于判定宮頸癌的進展程度具有重要的臨創(chuàng)意義。

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（收稿日期：2018-06-28? 本文編輯：蘇? ?暢）