許敏 江鴻 牟丹 牟耀華 藍(lán)巧

[摘要]目的 比較湖北省恩施州利川市人民醫(yī)院土家族和漢族育齡婦女亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C667T、A1298C基因位點(diǎn)及甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）A66G基因位點(diǎn)多態(tài)性分布的情況，研究其位點(diǎn)的群體遺傳性特征。方法 以2015年1月～2017年12月在湖北省恩施州利川市人民醫(yī)院建卡的681例漢族和553例土家族孕期女性作為研究對(duì)象，采集口腔黏膜上皮細(xì)胞提取DNA樣本，采用Taqman-MGB技術(shù)進(jìn)行MTHFR和MTRR基因多態(tài)性檢測(cè)，并統(tǒng)計(jì)分析基因多態(tài)性的分布特征與已報(bào)道其他地區(qū)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。結(jié)果 湖北省恩施州利川市人民醫(yī)院土家族女性的MTHFR C677T位點(diǎn)的等位基因頻率與延邊朝鮮族、南寧壯族、烏蘇哈薩克族、銀川回族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;MTHFR A1298C位點(diǎn)的等位基因頻率與南寧壯族、烏蘇哈薩克族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;利川土家族婦女MTRR A66G位點(diǎn)的等位基因頻率與烏蘇哈薩克族、新疆維吾爾族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。利川土家族MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)存在完全連鎖不平衡現(xiàn)象（D′=1.0，r2=0.508）。利川市漢族MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)存在完全連鎖不平衡現(xiàn)象（D′=1.0，r2=0.424）。結(jié)論 湖北省恩施州利川市土家族和漢族MTHFR和MTRR的基因多態(tài)性分布差異性并不顯著，但其地區(qū)婦女的上述基因分布具有區(qū)域特異性，不同于其他地區(qū)。

[關(guān)鍵詞]葉酸;亞甲基四氫葉酸還原酶;甲硫氨酸合成酶還原酶;基因多態(tài)性分布

[中圖分類號(hào)] R737.33? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）3（a）-0192-05

葉酸作為人體所必需的B族維生素，參與人體眾多重要物質(zhì)的合成和代謝。葉酸的缺乏可以導(dǎo)致基因組DNA鏈的斷裂、染色體的不穩(wěn)定及尿嘧啶的錯(cuò)配等，進(jìn)而破壞了DNA的合成和修復(fù)，影響核酸、組蛋白甲基化修飾的改變[1]。葉酸代謝酶亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）的基因多態(tài)性是影響唇裂、唐氏綜合征等疾病發(fā)病的重要因素[2-3]。葉酸代謝基因與某些臨床不良事件存在一定的相關(guān)性，如不良妊娠事件（復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、低體重患兒、早產(chǎn)兒和出生缺陷等）、癌癥（胃癌、大腸癌和宮頸癌等）、心血管疾病和精神疾病等。

研究表明，MTHFR C677T和MTRR A66G位點(diǎn)的突變是導(dǎo)致葉酸水平下降，從而導(dǎo)致嬰兒發(fā)生神經(jīng)管畸形和其他出生缺陷的高危因素[4-5]。此外，MTHFRA1298C雖未被證實(shí)和出生缺陷的發(fā)生存在必要關(guān)系，但其基因多態(tài)性與血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平具有顯著相關(guān)性[6]，而Hcy水平偏高是影響神經(jīng)管畸形、先天性心臟病、唇腭裂等出生缺陷的危險(xiǎn)因素之一[7]。

本研究的目的在于探討湖北省恩施利川市漢族婦女人群MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G位點(diǎn)多態(tài)性分布情況，獲得本地區(qū)的群體遺傳特征，同時(shí)將本文數(shù)據(jù)與其他地區(qū)少數(shù)民族人口進(jìn)行對(duì)比，為不同地域的人群預(yù)防出生缺陷制定具有針對(duì)性的干預(yù)措施提供有效的科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

本研究經(jīng)湖北省恩施州利川市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，排除非本地區(qū)戶籍及DNA抽提不合要求的樣本，選取2015年1月～2017年12月在湖北省利川市人民醫(yī)院建卡及做孕期保健的553例土家族和681例漢族女性作為研究對(duì)象。在受檢者知曉本研究情況并簽署知情同意書后，通過(guò)提取口腔黏膜細(xì)胞中的DNA，進(jìn)行基因檢測(cè)，評(píng)估其葉酸利用能力。

1.2方法

1.2.1儀器及試劑

MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)和MTRR基因A66G位點(diǎn)的SNP分型采用Taqman-MGB技術(shù)測(cè)定。

1.2.1.1儀器? 低溫離心機(jī)Beckman J-6BABI、7900型熒光定量PCR儀，相關(guān)儀器均使用美國(guó)Applied Biosystems（AB）公司產(chǎn)品。

1.2.1.2試劑? Buffer A、Buffer B、飽和酚、氯化鈉及異丙醇等，相關(guān)試劑均使用美國(guó)AB公司產(chǎn)品。

1.2.2樣本DNA的采集

由經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的人員進(jìn)行樣本采集工作。使用專用的口腔黏膜上皮細(xì)胞采集器進(jìn)行操作，提取受檢者的口腔黏膜上皮細(xì)胞，具體方法為：在口腔內(nèi)一側(cè)上下刮拭40次以上，力量以略微鼓起為宜，然后利用柱式抽提試劑盒抽提樣本的DNA。

1.2.3基因檢測(cè)

MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)和MTRR A66G基因位點(diǎn)的SNP分型采用Taqman-MGB技術(shù)測(cè)定，相關(guān)儀器、試劑均使用美國(guó)AB公司產(chǎn)品。

1.2.4熒光定量PCR檢測(cè)

對(duì)3個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)所用探針信息如表1所示。

每個(gè)反應(yīng)體系的總體積為10 μl，包含濃度為20 ng/μl的DNA模板1 μl，2×Taqman Universal Master Mix 5 μl，20×Taqman-MGB探針0.5 μl，去離子水3.5 μl。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)熱10 min，隨后在92℃下15 s，60℃ 1 min的條件下進(jìn)行20個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，再接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（80℃ 15 s，60℃ 90 s）。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點(diǎn)熒光，利用分析軟件確定各個(gè)樣品的基因分型結(jié)果。

1.3觀察指標(biāo)

樣本MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)和MTRR基因A66G位點(diǎn)基因多態(tài)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用HaploView 4.2軟件進(jìn)行SNPs的Hardy-Weinberg平衡及連鎖不平衡水平（LD）分析。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

本研究Hardy-Weinberg平衡校驗(yàn)?zāi)康氖球?yàn)證樣本的可靠性。結(jié)果表明，收集到的湖北省恩施利川市土家族和漢族人群的MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性分布情況符合遺傳平衡（P>0.05），數(shù)據(jù)來(lái)自同一孟德?tīng)柸后w，樣本具有區(qū)域代表性。

2.2各民族育齡婦女MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)基因型構(gòu)成的比較

本研究采用思南苗族[8]、延邊朝鮮族[9]、南寧壯族[10]、烏蘇哈薩克族[11]、銀川回族[12]、新疆維吾爾族[13]數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，研究結(jié)果提示，湖北省恩施州利川土家族和漢族婦女之間各位點(diǎn)的基因型構(gòu)成比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。利川土家族婦女MTHFR C677T位點(diǎn)的基因型構(gòu)成與延邊朝鮮、南寧壯族、烏蘇哈薩克族、銀川回族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;利川土家族婦女MTHFR A1298C位點(diǎn)的基因型構(gòu)成與南寧壯族、烏蘇哈薩克族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;利川土家族婦女MTRR A66G位點(diǎn)的基因型構(gòu)成與烏蘇哈薩克族、新疆維吾爾族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.3各民族育齡婦女MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)等位基因頻率的比較

湖北省恩施州利川土家族和漢族婦女之間各位點(diǎn)的等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。利川土家族婦女MTHFR C677T位點(diǎn)的等位基因分布與延邊朝鮮、南寧壯族、烏蘇哈薩克族、銀川回族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;利川土家族婦女MTHFR A1298C位點(diǎn)的等位基因頻率與南寧壯族、烏蘇哈薩克族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;利川土家族婦女MTRR A66G位點(diǎn)的等位基因頻率與烏蘇哈薩克族、銀川回族、新疆維吾爾族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

2.4 MTHFR C677T和MTHFR A1298C位點(diǎn)組合情況

湖北省恩施州利川市土家族婦女MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)出現(xiàn)了6種組合情況，最常見(jiàn)的三種組合依次為：CT/AA 35.5%、CC/AC 19.3%、CC/AA 17.9%（表4）。單倍型分析表明，存在三種組合：CA（65.9%），TC（20.8%），TA（13.3%）。MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)存在較大程度的連鎖不平衡現(xiàn)象（D′=1.0，r2=0.508）。漢族婦女MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)出現(xiàn)了6種組合情況，最常見(jiàn)的三種組合依次為：CT/AA 32.5%、CT/AC 24.9%、CC/AC 18.4%（表4）。單倍型分析表明，存在三種組合：CA（63.1%），TC（19.8%），TA（17.0%）。MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)存在連鎖不平衡現(xiàn)象（D′=1.0，r2=0.424）。

3討論

葉酸是一種重要的人體必需營(yíng)養(yǎng)素，是水溶性B族維生素家族中的一員。1941年，美國(guó)科學(xué)家米切爾在菠菜中發(fā)現(xiàn)葉酸[14]。葉酸分為天然葉酸和合成葉酸兩種。天然葉酸廣泛存在于動(dòng)植物食品中，在酵母、肝臟以及蔬菜中含量尤為豐富。由于食物中的葉酸易被光照、加熱等環(huán)境因素影響，因此日常膳食中的葉酸在人體內(nèi)生物利用度較低。與之相比，合成葉酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，故廣泛應(yīng)用于圍生期婦女等需要長(zhǎng)期補(bǔ)充葉酸的人群[15]。

自2000年中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)首次將葉酸列入膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量以來(lái)，我國(guó)居民的葉酸攝入量得到明顯改善。一項(xiàng)中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)狀況調(diào)查研究中顯示[16]，中國(guó)3～12歲兒童葉酸水平為7.62 mg/L，總?cè)狈β蕿?.52%。健康成年人的葉酸水平檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果提示，葉酸缺乏率隨年齡增長(zhǎng)呈“兩邊高，中間低”的趨勢(shì)，這可能與兒童與老年人葉酸吸收代謝功能差有關(guān)。研究結(jié)果還表明[17]，男性血清葉酸缺乏率明顯高于女性，這可能與男性吸煙和飲酒史等因素相關(guān)。根據(jù)我國(guó)35～64歲人群血液葉酸狀況較大樣本調(diào)查結(jié)果顯示，南方夏秋季節(jié)紅細(xì)胞葉酸與冬春季節(jié)相比顯著下降，北方則顯著升高[18]。由此可見(jiàn)，葉酸補(bǔ)充劑量的制定應(yīng)該綜合考慮到人群、地區(qū)等多方面差異。

本研究結(jié)果提示，湖北恩施利川市土家族和漢族婦女的葉酸代謝遺傳多態(tài)性分布和其他民族漢族婦女存在差異。湖北省恩施州利川市利川土家族和漢族婦女之間各基因分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。湖北省恩施州利川市土家族MTHFR 677TT純合突變基因型頻率為10.8%，低于利川漢族（13.7%）、思南苗族（12.9%）、延邊朝鮮（18.8%）、新疆維吾爾族（10.9%），高于南寧壯族（5.1%）、烏蘇哈薩克族（5.0%）、銀川回族（6.5%），與延邊朝鮮族、南寧壯族、烏蘇哈薩克族、銀川回族比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;MTHFR A1298C位點(diǎn)基因型分布與南寧壯族、烏蘇哈薩克族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而MTRR A66G位點(diǎn)的基因型分布與烏蘇哈薩克族、新疆維吾爾族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)對(duì)比，MTHFR、MTRR的基因多態(tài)性分布受到民族影響，具有一定的民族特異性。

綜上所述，本文通過(guò)開(kāi)展對(duì)湖北省恩施利川市土家族和漢族MTHFR和MTRR基因多態(tài)性和地區(qū)分布特征的研究，了解湖北省恩施利川市不同民族和不同地區(qū)的葉酸代謝相關(guān)基因的多態(tài)性分布。為我國(guó)制定個(gè)性化的葉酸補(bǔ)充方案和各項(xiàng)婦幼保健政策的制定提供有力的理論支持。

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（收稿日期：2018-10-11? 本文編輯：孟慶卿）