李定祥 牛明輝 張杰?

夏枯草口服液由單味中藥夏枯草制備而成。《中國藥典》［1］指出夏枯草有清火、明目、散結(jié)、消腫的功效，具有降壓、降糖、抗菌、抗炎、抗過敏及抗病毒等藥理作用。臨床研究表明，夏枯草可顯著降低IL-1β、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子水平［2-3］，對亞急性甲狀腺炎［4-5］、慢性乳腺炎［6］等炎性疾病也有顯著療效。JAK-STAT3信號通路是介導(dǎo)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)的重要通路，與體內(nèi)炎癥反應(yīng)具有非常密切的關(guān)系［7］。核因子KB（NF-KB）是一組調(diào)節(jié)廣泛基因表達(dá)的核蛋白因子，在參與炎癥反應(yīng)，細(xì)胞增殖、分化與凋亡，免疫反應(yīng)和腫瘤形成等相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中有重要作用［8-9］。本文研究夏枯草口服液對STAT3及NFKB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器 超凈臺（上海上凈凈化設(shè)備有限公司），電子天平（METTLER TOLEDO AL104型），Eppendorf 5810R離心機(jī)，徠卡Leica DMI3000 B倒置顯微鏡，Thermo CO2培養(yǎng)箱，TECAN F200酶標(biāo)儀。

1.2 藥物與試劑 α-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（Gibco公司，批號10099-141），胰酶（Amresco公司），雙抗（Amresco公司），熒光素酶檢測試劑盒（Promega公司），IL-6（ProTech公司），TNF-α（Sigma公司）。4#細(xì)胞（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了STAT1-luciferase和STAT3-luciferase報告基因質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)條件為α-MEM+10%FBS），14#細(xì)胞（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了NF-KB-luciferase報告基因質(zhì)粒的293細(xì)胞，培養(yǎng)條件為DMEM+10%FBS）。夏枯草口服液（貴陽新天藥業(yè)股份有限公司，批號：170821）。

1.3 樣品制備 用直徑為22μM的微孔濾膜正壓過濾夏枯草口服液（總黃酮：11.7mg/ml；迷迭香酸：2.01mg/ml），經(jīng)冷凍干燥成粉末，取夏枯草口服液凍干粉適量，以無菌超純水配制成200mg/ml的溶液，再以無菌超純水梯度稀釋得 100mg/ml、50mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml、0.04mg/ml，置 -80℃冰箱過夜，備用。臨用前，以培養(yǎng)基稀釋10倍后用于篩選。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及活性測定 人腫瘤細(xì)胞4#HepG2細(xì)胞和14#293細(xì)胞，細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清液，適量培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105/ml。將細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)48h后，吸去培養(yǎng)基，夏枯草組每孔加入100μl稀釋好的藥物，每藥設(shè)2復(fù)孔。夏枯草口服液終濃度分別為 20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.02mg/ml和 0.004mg/ml。培養(yǎng) 1h 后每孔加入激動劑（IL-6/TNF-α，10ng/ml）11μl。設(shè)陰性對照組，不加激動劑和夏枯草溶液，設(shè)模型組，加入激動劑，但不加夏枯草溶液。培養(yǎng)5.5h棄去培養(yǎng)基，每孔加入1×細(xì)胞裂解液30μl，震蕩使細(xì)胞充分裂解。取20μl到酶標(biāo)板中，加入30μl熒光素酶底物。酶標(biāo)儀檢測，計算抑制率［抑制率%=（模型組熒光強(qiáng)度-夏枯草組熒光強(qiáng)度）/模型組熒光強(qiáng)度×100%］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Prism Graphpad統(tǒng)計軟件計算IC50值。

2 結(jié)果

2.1 夏枯草口服液抑制STAT3信號通路 IL-6可激活STAT3信號通路，熒光強(qiáng)度OD值為620.0。夏枯草口服液0.5 mg/ml對STAT3信號通路抑制率為57.18%，1mg/ml時抑制率81.53%，20 mg/ml時抑制率為98.55%，表明夏枯草口服液對IL-6誘導(dǎo)的STAT3信號通路具有抑制作用，在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性（見表1）。其抑制STAT3的IC50為0.4591mg/ml（見圖1）。

表1 夏枯草口服液抑制STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活力

圖1 夏枯草口服液抑制STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路IC50

2.2 夏枯草口服液抑制NF-KB信號通路 TNF-α可激活NF-KB信號通路，熒光強(qiáng)度OD值為12958.5。夏枯草口服液0.5mg/ml對STAT3信號通路抑制率為58.36%，1mg/ml時抑制率91.29%，20mg/ml時抑制率為99.94%，表明夏枯草口服液對TNF-α誘導(dǎo)的NF-KB信號通路具有抑制作用，且呈濃度依賴性（見表2），其抑制NF-KB的IC50為0.3719mg/ml（見圖2）。

表2 夏枯草口服液抑制NF-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活力

圖2 夏枯草口服液抑制NF-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路IC50

3 討論

信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）蛋白家族是一個由STAT 基因編碼合成的蛋白質(zhì)家族，可以被不同的細(xì)胞因子受體激活，在細(xì)胞因子-受體相互作用的過程中充當(dāng)載體，保持信號在細(xì)胞內(nèi)傳遞的內(nèi)在特異性［10］。STAT的七個蛋白家族中，STAT3是一種廣泛表達(dá)于人和鼠各組織細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。JAK/STAT3信號通路是STAT3活化的一條經(jīng)典途徑，較多細(xì)胞因子和生長因子通過JAK-STAT信號通路來傳導(dǎo)信號，包括白介素2～7、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子、生長激素、表皮生長因子、血小板衍生因子及干擾素等。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3信號通路參與較多生理病理過程，STAT3的異?；罨蓪?dǎo)致先天免疫、適應(yīng)性免疫，急、慢性炎癥，及腫瘤等疾病的發(fā)生［11］，是炎癥形成過程中不可或缺的關(guān)鍵性因素［12-13］。

核因子KB（NF-KB）是從鼠B淋巴細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種核蛋白因子。在靜息狀態(tài)下，IκB-α與NF-KB p65、p50兩個亞單位以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。腫瘤壞死因子TNF作用于腫瘤壞死因子受體TNFR，激活I(lǐng)KK（IκB kinase），活化的IKK會泛素化、磷酸化并降解IκB-α，使NF-KB兩個亞單位從失活狀態(tài)活化，并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)（尤其是p65亞單位），與相應(yīng)的炎癥相關(guān)基因結(jié)合，啟動炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥［14］。

本資料結(jié)果顯示，夏枯草口服液對IL-6誘導(dǎo)的STAT3信號通路和TNF-α誘導(dǎo)的NF-KB信號通路具有抑制作用，且呈濃度依賴性，揭示夏枯草口服液的體外抗炎作用機(jī)制，其對JAK-STAT、NF-KB信號通路的抑制作用需要進(jìn)一步體內(nèi)試驗的驗證，進(jìn)一步明確其體內(nèi)抗炎作用。同時還需要進(jìn)一步探究其發(fā)揮抗炎作用機(jī)制的物質(zhì)基礎(chǔ)。夏枯草含有的化學(xué)成分種類較多，酚酸是廣泛存在于夏枯草中的一類主要活性成分，文獻(xiàn)報道夏枯草中酚酸主要有迷迭香酸、迷迭香酸丁酯、咖啡酸、丹參素、迷迭香酸甲酯、3，4-二羥基苯甲酸等［15］。前期研究中發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹、醋酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性增高及大鼠棉球肉芽腫性炎癥。另外，迷迭香酸能降低炎癥模型動物血清中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、CRP的含量［16］。需要進(jìn)一步驗證迷迭香酸是否為夏枯草口服液抑制JAK-STAT、NF-KB信號通路的物質(zhì)基礎(chǔ)，為夏枯草口服液抗炎作用機(jī)制提供依據(jù)，為夏枯草的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步開發(fā)起指導(dǎo)作用。