沈曉燕 朱磊 張佳穎 梁若笳?

卵巢癌是具侵襲性婦科腫瘤，死亡率居?jì)D科腫瘤的首位。在細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上，以順鉑（DDP）為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案已成為卵巢癌的常規(guī)治療方案，然而，對(duì)DDP的腫瘤多藥耐藥（MDR）是導(dǎo)致卵巢癌化療失敗、死亡率高的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞耐藥性的發(fā)展與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）密切相關(guān)［1］。中藥紅花中水溶性成分羥基紅花黃色素A（HSYA），具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、抗凝、抗炎鎮(zhèn)痛等多種作用。本文探討HSYA對(duì)人卵巢癌A2780/DDP細(xì)胞株順鉑耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及對(duì)MAPK/ERK信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人卵巢癌敏感株A2780及其DDP耐藥株A2780/DDP，中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑與儀器 （1）主要試劑：HSYA（江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)146087-19-6，純度＞98%）；DDP（德州德藥制藥有限公司，批號(hào)37020523）；1640培養(yǎng)基：GIBCO Company；胎牛血清：Hyclone Company；胰酶：GIBCO Company；Erk1/2，P-Erk1/2和GAPDH抑制劑（美國(guó)Sigma Chemical公司）；ECL Plu試劑盒（Bio-Rad 公司）；Tris緩沖液（SIGMA公司）。（2）主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱：3111 型，Thermo 公司；倒置顯微鏡：ECLIPSE Ti-S型，Nikon公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)皿：Fisher Scientific 公司；NovoCyte 流式細(xì)胞儀，艾森生物（ACEA）；RTCA儀器：xCELLigence 細(xì)胞功能分析儀DP系統(tǒng)；艾森生物（ACEA）；微量加樣器：RAININ公司；渦旋振蕩儀：Bio-Rad 公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：ST16R，Thermo Fisher 公司；組織樣本研磨器：Fastprep-24 5G，MP；酶標(biāo)儀：1681130-4B，Bio-Rad 公司；電泳系統(tǒng)：Mini-Proten Tetra System，Bio-Rad 公司；凝膠成像儀：ChemiDocTM Touch Imaging System，Bio-Rad 公司。

1.2 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：將A2780用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ng/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃，CO2濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱溫育。A2780/DDP用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ng/ml鏈霉素和2μg/ml DDP的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃，CO2濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱溫育。（2）篩選DDP濃度：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A2780和A2780/DDP細(xì)胞，分別設(shè)立空白對(duì)照組，接種于96孔板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)平行孔，每孔100μl，含 1×104個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度DDP（4μg/ml、6μg/ml、12μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、等體積的培養(yǎng)基），培養(yǎng)76h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值（A）。細(xì)胞的存活率（%）=（AA2780/順鉑組/A模型組）×100%。測(cè)得A2780/DDP細(xì)胞50%存活率的DDP濃度為25μg/ml，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（3）實(shí)驗(yàn)分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A2780和A2780/DDP細(xì)胞，分為正常組（A2780細(xì)胞）和耐藥組（A2780/DDP細(xì)胞），其中耐藥組又分成順鉑組、HSYA組、聯(lián)合組和對(duì)照組，分別接種于96孔板中培養(yǎng)。（4）檢測(cè)A2780/DDP細(xì)胞存活率：取順鉑組、聯(lián)合組及對(duì)照組細(xì)胞，順鉑組中加入25μg/ml DDP，聯(lián)合組加入25μg/ml DDP和1mg/ml HSYA，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基。每隔12h，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各組的吸光值（A）。細(xì)胞的存活率（%）=（AA2780/順鉑組/A模型組）×100%。（5）檢測(cè)A2780/DDP細(xì)胞遷移能力：在E-Plate檢測(cè)板中加入50μl培養(yǎng)基并測(cè)定背景阻抗值。將順鉑組、聯(lián)合組及對(duì)照組細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104/ml，取100μl的細(xì)胞懸浮液加入至E-Plate檢測(cè)板中，室溫下放置30min后，每間隔15min使用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)（RTCA）進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的細(xì)胞指數(shù)檢測(cè)。檢測(cè)24h后，順鉑組培養(yǎng)孔中加入25μg/ml DDP，聯(lián)合組加入25μg/ml DDP和1mg/ml HSYA，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基。60h內(nèi)每隔15min檢測(cè)1次以觀察長(zhǎng)期療效。（6）檢測(cè)A2780/DDP細(xì)胞凋亡率：取順鉑組、聯(lián)合組及對(duì)照組細(xì)胞接種于6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。順鉑組加入25μg/ml DDP，聯(lián)合組加入25μg/ml DDP和1mg/ml HSYA，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h，胰酶消化后收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，1000r/min離心5min。加入100μl Annexin V-PE結(jié)合液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15min后，1000r/min離心5min，用PBS洗滌沉淀細(xì)胞。加入熒光溶液4℃下孵育20min，避光并不時(shí)振動(dòng)。24h后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析細(xì)胞凋亡率。（7）Western blot檢測(cè)：取正常組、耐藥組中的對(duì)照組和HSYA組細(xì)胞，接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。正常組和對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，HSYA組加入1mg/ml HSYA。培養(yǎng)48h，PBS洗2次，胰酶消化，加入10ml 培養(yǎng)液，制備成細(xì)胞懸液，多次離心棄上清液后，加入200μl細(xì)胞裂解液，裂解蛋白后離心。使用考馬斯亮藍(lán)染料法測(cè)定蛋白濃度。用SDS-PAGE緩沖液稀釋等量蛋白，再進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，分離的蛋白帶電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶室溫封閉1h，分別用Erk1/2、P-Erk1/2和Gapdh單克隆抗體孵育4℃過(guò)夜。用Tris緩沖液洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h，Tris緩沖液洗膜，加入ECL，混勻后加在PVDF膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學(xué)光敏模式曝光顯影。使用ImageJ 軟件分析各條帶光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料均以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSYA對(duì)A2780/DDP細(xì)胞存活率的影響 當(dāng)濃度為25μg/ml的DDP聯(lián)合HSYA作用24h后，聯(lián)合組的A2780/DDP細(xì)胞存活率明顯低于單純的順鉑組（P＜0.01），且隨著時(shí)間的增加差異增大；作用48h后，聯(lián)合組A2780/DDP細(xì)胞存活率＜50%（見圖1）。

圖1 A2780/DDP細(xì)胞隨時(shí)間變化的存活率

2.2 HSYA對(duì)A2780/DDP細(xì)胞遷移能力的影響 在實(shí)驗(yàn)的前30h，順鉑組、聯(lián)合組及對(duì)照組的A2780/DDP細(xì)胞的遷移能力隨著時(shí)間的增加而增加；作用30h后，模型組細(xì)胞遷移能力仍在增加，而順鉑組和聯(lián)合組A2780/DDP細(xì)胞的遷移能力明顯下降，且聯(lián)合組的下降趨勢(shì)較順鉑組更顯著（P＜0.01）（見圖2）。

2.3 HSYA對(duì)A2780/DDP細(xì)胞凋亡率的影響 對(duì)照組A2780/DDP細(xì)胞早期細(xì)胞凋亡率和晚期細(xì)胞凋亡率分別為0.36%和0.09%，總凋亡率為0.47%；順鉑組A2780/DDP細(xì)胞早期細(xì)胞凋亡率和晚期細(xì)胞凋亡率分別為7.92%和6.33%，總凋亡率為14.25%；聯(lián)合組A2780/DDP細(xì)胞早期細(xì)胞凋亡率和晚期細(xì)胞凋亡率分別為9.36%和15.66%，總凋亡率為25.02。與對(duì)照組和順鉑組相比，聯(lián)合組A2780/DDP細(xì)胞凋亡率明顯上升（P＜0.01）。

圖2 A2780/DDP細(xì)胞隨時(shí)間變化的細(xì)胞遷移能力

2.4 HSYA對(duì)MAPK/ERK的影響 Western blot結(jié)果提示，與正常組相比，對(duì)照組Erk1/2、p-Erk1/2蛋白含量明顯增加（P＜0.05），HSYA組則無(wú)明顯差異。經(jīng)HSYA干預(yù)后，A2780/DDP細(xì)胞中Erk1/2、p-Erk1/2蛋白含量較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）（見圖3）。

2.5 HSYA對(duì)EMT的影響 Western blot結(jié)果提示，與正常組比較，對(duì)照組E-cadherinl表達(dá)減少，Vimentin、Snail和 Twist蛋白含量明顯增加（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，HSYA組E-cadherinl 表達(dá)增加，Vimentin、Snail和Twist表達(dá)顯著下降（P＜0.05）（見圖4）。

圖3 各組細(xì)胞Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表達(dá)情況

圖4 各組細(xì)胞EMT過(guò)程中E-cadherinl、Vimentin、Snail和Twist蛋白表達(dá)情況

3 討論

卵巢癌在女性癌癥中排名第3位，多發(fā)生在圍絕經(jīng)期婦女中，近年來(lái)發(fā)病年齡趨于年輕化［2］。由于卵巢癌早期癥狀隱匿和缺乏有效的診斷方法，60%～70%的卵巢癌患者在確診時(shí)已處于Ⅲ～Ⅳ期或腹部轉(zhuǎn)移，因此其5年生存率＜40%。術(shù)后以鉑類（順鉑或卡鉑）為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是目前的標(biāo)準(zhǔn)治療。盡管初始反應(yīng)率一致，最初鉑類敏感的患者最終易產(chǎn)生化學(xué)抗性，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展。因此，逆轉(zhuǎn)卵巢癌的化療耐藥是延長(zhǎng)卵巢癌生存期的核心問(wèn)題。

卵巢癌對(duì)順鉑耐藥的分子機(jī)制尚不明確，越來(lái)越多研究表明，卵巢癌耐藥的發(fā)生與MAPK/ERK信號(hào)調(diào)控EMT狀態(tài)密切有關(guān)。MAPK是細(xì)胞內(nèi)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，也是調(diào)控EMT的主要信號(hào)途徑。經(jīng)典的MAPK家族介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、p38 MAPK、c-Jun N-末端激酶和其他亞家族［3］，近年來(lái)研究證實(shí)MAPK/ERK通路在腫瘤耐藥及轉(zhuǎn)移中起重要作用。Xu W等發(fā)現(xiàn)活化T細(xì)胞核因子（NFATC1）可通過(guò)激活ERK1/2/p38/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［4］。Chang MC等［5］發(fā)現(xiàn)間皮素（MSLN）可通過(guò)MAPK/ERK和JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過(guò)MMP-7表達(dá)增強(qiáng)卵巢癌侵襲。Hou L等［6］研究證實(shí)，Erk的磷酸化和EMT過(guò)程的激活有助于增強(qiáng)SKOV-3/DDP對(duì)順鉑的抗性，使用MEK抑制劑PD98059可顯著抑制SKOV-3/DDP的ERK途徑和EMT過(guò)程，抑制細(xì)胞增殖，減少遷移面積。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT比色法、RTCA法和流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DDP與HSYA聯(lián)用可以降低A2780/DDP細(xì)胞的存活率、抑制A2780/DDP細(xì)胞的遷移能力、提高A2780/DDP細(xì)胞的凋亡率，從而驗(yàn)證DDP聯(lián)合HSYA能夠增加A2780/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。Western blott則進(jìn)一步表明，對(duì)照組Erk1/2、p-Erk1/2表達(dá)增加，E-cadherinl表達(dá)減少，Vimentin、Snail和Twist蛋白含量增加，證實(shí)卵巢癌順鉑耐藥與體內(nèi)MEPK/ERK信號(hào)通路異常促進(jìn)EMT有關(guān)。而經(jīng)HSYA用藥后，A2780/DDP細(xì)胞的Erk1/2、p-Erk1/2顯著下降；與之相反，EMT過(guò)程的關(guān)鍵性因子Vimentin、Snail和Twist表達(dá)均減少。基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者認(rèn)為，HSYA可以有效增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，其機(jī)制是通過(guò)減少Erk1/2、p-Erk1/2表達(dá)，干預(yù)MAPK/ERK信號(hào)通路，從而抑制EMT的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥。