黃子逸，陳晨，彭雪楠，申春蘋，朱一蓓，王雪峰，張學(xué)光

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院江蘇省臨床免疫研究所，江蘇 蘇州215006；2.江蘇省臨床免疫學(xué)重點實驗室，江蘇 蘇州215006；3.江蘇省胃腸道腫瘤免疫重點實驗室，江蘇 蘇州215006；4.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，江蘇 蘇州215123；5.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)系，江蘇 蘇州215123）

最近程序性死亡受體-1（programmed death-1，PD-1）免疫卡控點治療性抗體帶來了前所未有的臨床效益［1］，但作為臨床抗腫瘤藥物，PD-1抗體須通過體外無血清培養(yǎng)進(jìn)行制備，并避免動物來源成分和內(nèi)毒素污染。在基因工程抗體的生產(chǎn)制備過程中，增加抗體表達(dá)可以降低治療性抗體的生產(chǎn)成本［2］。293F細(xì)胞具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)表達(dá)加工能力，因此常用于表達(dá)外源重組蛋白［3］。研究表明，添加小分子短鏈脂肪酸丁酸鈉是一種提高真核細(xì)胞蛋白產(chǎn)量經(jīng)濟(jì)有效的方法［4］。丁酸鈉可增加真核細(xì)胞中凝血因子、組織纖溶酶原激活物、促紅細(xì)胞生成素等各種蛋白的表達(dá)［5-7］，增加程度取決于蛋白產(chǎn)物種類。另有研究表明，丁酸鈉可一定程度抑制細(xì)胞生長、阻斷細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。因此，單獨使用丁酸鈉易致細(xì)胞凋亡和改變N-糖基化相關(guān)基因表達(dá)［9-11］，對細(xì)胞生長和蛋白產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響。

CHO CD Efficient Feed（以下簡稱Feed）補(bǔ)充劑可為細(xì)胞培養(yǎng)提供增強(qiáng)代謝的營養(yǎng)元素，與常規(guī)培養(yǎng)條件相比，添加Feed的細(xì)胞生長和蛋白產(chǎn)量顯著增加。細(xì)胞擴(kuò)增期間，隨著營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，積累的細(xì)胞代謝物對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，培養(yǎng)環(huán)境滲透壓升高［12］。Feed可補(bǔ)充細(xì)胞增殖過程中培養(yǎng)基所消耗的成分而不額外增加鹽離子或未消耗的氨基酸等，充分保護(hù)細(xì)胞免受自由基和細(xì)胞凋亡引起的損傷。

PD-1（CD279）作為免疫卡控點受體分子［13］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。阻斷PD-1／PD-L1信號可增強(qiáng)腫瘤和病毒特異性CD8+T細(xì)胞的活性，從而增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對腫瘤和病毒的殺傷能力［14-15］。目前，抗人PD-1單克隆抗體作為腫瘤免疫治療的有效靶分子已在臨床治療中取得顯著成效［16］?；谖覀兦捌谧灾餮兄频目谷薖D-1嵌合抗體，瞬時轉(zhuǎn)染獲得表達(dá)抗人PD-1基因工程抗體的293F細(xì)胞，本研究旨在用不同濃度的丁酸鈉配合Feed處理293F細(xì)胞，觀察和比較不同培養(yǎng)條件對細(xì)胞生長代謝和表達(dá)PD-1抗體的影響；并在細(xì)胞培養(yǎng)期間檢測細(xì)胞周期，測定單抗表達(dá)量，以達(dá)到抗體產(chǎn)量的最大化。

1 材料和方法

1.1 293F細(xì)胞傳代培養(yǎng)

取1 L不含L-谷氨酰胺的Hyclone SFM4 Transfx-293培養(yǎng)基，加入10 mL L-谷氨酰胺（200 mmol／L）。將細(xì)胞用新鮮配制的Hyclone培養(yǎng)基懸浮在三角搖瓶（Thermo Fisher公司）中，于37℃，8%CO2和一定濕度的培養(yǎng)箱進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2 293F細(xì)胞的培養(yǎng)

在轉(zhuǎn)染前1天將培養(yǎng)基更換成Gibco?Free-StyleTM293表達(dá)培養(yǎng)基。傳代前細(xì)胞計數(shù)保持在1.5×106／mL。收集細(xì)胞并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，以600×g常溫離心5 min；棄上清液，并用新鮮的FreeStyleTM293培養(yǎng)基重懸。

1.3 轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）的制備

稱取100 mg PEI溶于95 mL Milli-Q水中，逐滴加入濃HCl直至溶液pH＝2.0，磁力攪拌直至PEI溶解；緩慢滴加5 mol／L NaOH溶液將pH調(diào)至7.2；繼續(xù)加Milli-Q水直至PEI終體積為100 mL，0.2 μm膜過濾滅菌。

1.4 丁酸鈉溶液的制備

PBS溶解丁酸鈉粉劑（Sigma公司），制備1 mol／L的儲備溶液，并用0.2μm膜過濾滅菌，-20℃儲存。

1.5 瞬時轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞的培養(yǎng)

取2×106／mL細(xì)胞接種于50 mL flask瓶中，分為A，B組，每組分別加入濃度梯度丁酸鈉，即0，0.5，1.0，2.0，4.0 mmol／L，分別記為A1～A5，B1～B5；A組細(xì)胞培養(yǎng)過程中于第1，3，5天額外添加5%Feed添加劑（美國Gibco公司），B組則不加。每24 h計數(shù)細(xì)胞并收集一定量的細(xì)胞樣本檢測細(xì)胞周期。

1.6 培養(yǎng)過程中293F活細(xì)胞密度的測定

根據(jù)本實驗的檢測要求，利用Countsar全自動細(xì)胞計數(shù)儀，每日取樣進(jìn)行細(xì)胞精確計數(shù)，獲得細(xì)胞活率、細(xì)胞平均直徑、細(xì)胞平均圓度等測量結(jié)果，觀察細(xì)胞結(jié)團(tuán)情況。

1.7 抗人PD-1嵌合單抗的表達(dá)及定量

本所自行研制分泌抗人PD-1單抗的雜交瘤細(xì)胞株，收集細(xì)胞提取cDNA；利用特定設(shè)計的上、下游引物，PCR克隆該雜交瘤細(xì)胞重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；重、輕鏈可變區(qū)PCR產(chǎn)物與酶切預(yù)先處理的線性表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌；測序并挑選轉(zhuǎn)化菌，擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒；單抗重鏈和輕鏈可變區(qū)的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞株293F細(xì)胞；連續(xù)培養(yǎng)7 d，4 000×g常溫離心30 min；取含有目的抗體的上清液，流式細(xì)胞術(shù)檢測表達(dá)單抗與L929／PD-1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞結(jié)合良好，陽性率為95%以上。

收獲培養(yǎng)上清液，過Protein A親和層析柱，用100 mmol／L的甘氮酸（pH＝2.6）洗脫；預(yù)先加入1 mol／L Tris緩沖液（pH＝9）于收集管中，中和洗脫樣品；將洗脫的抗體收集至離心管，4 000×g，4℃離心30 min。BCA蛋白定量試劑盒測定純化抗體濃度并電泳鑒定，根據(jù)抗體總量和表達(dá)體積計算產(chǎn)量（μg／mL）。

1.8 細(xì)胞周期檢測

細(xì)胞以500×g常溫離心5 min；預(yù)冷PBS洗2遍；細(xì)胞懸液500×g，4℃離心5 min；取細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至冰上，每管1×106個細(xì)胞重懸于PBS；逐滴緩慢加入預(yù)冷的無水乙醇至濃度為70%，4℃固定過夜；1 000×g，4℃離心5 min；棄上清液，將細(xì)胞重懸于1 mL PBS，500×g，4℃離心10 min；取細(xì)胞沉淀，重懸于500μL含50μg／mL的碘化吡啶和100μg／mL的RNA酶（Sigma公司）的PBS中，37℃避光孵育30 min；流式細(xì)胞儀檢測各組樣品的細(xì)胞周期。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)鑒定抗人PD-1嵌合抗體

轉(zhuǎn)染后第7天收集培養(yǎng)物，4 000×g，4℃離心20 min；純化抗體稀釋一定倍數(shù)后，與L929／PD-1細(xì)胞于4℃反應(yīng)40 min；PBS洗滌2次，加PE標(biāo)記的羊抗人IgG，F(xiàn)cγ鏈特異性反應(yīng)二抗，4℃反應(yīng)20 min；PBS洗2遍；細(xì)胞重懸于預(yù)冷的0.5 mL PBS，流式細(xì)胞術(shù)鑒定抗人PD-1嵌合抗體的表達(dá)水平與效價。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丁酸鈉和Feed影響293F細(xì)胞增殖與活細(xì)胞密度

A組中未加丁酸鈉處理的A1細(xì)胞第4天最大活細(xì)胞密度為7.66×106／mL，用0.5，1.0，2.0和4.0 mmol／L丁酸鈉處理的A2～A5細(xì)胞最大活細(xì)胞密度分別為5.80×106／mL，5.05×106／mL，5.21×106／mL，4.68×106／mL（圖1A）。相應(yīng)地，B組未處理細(xì)胞B1第4天最大活細(xì)胞密度為5.38×106／mL，加入濃度梯度丁酸鈉的B2～B5細(xì)胞最大活細(xì)胞密度分別為4.37×106／mL，3.29×106／mL，3.76×106／mL，3.54×106／mL（圖1B）。同組內(nèi)未用丁酸鈉處理的293F細(xì)胞最高活細(xì)胞數(shù)明顯多于丁酸鈉處理過的細(xì)胞；兩組間相比，添加Feed的A組細(xì)胞的增殖數(shù)量高于B組。

圖1 丁酸鈉和CHO CD Efficient Feed對293F活細(xì)胞密度的劑量效應(yīng)

2.2 不同濃度丁酸鈉對細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，丁酸鈉增加了G0／G1期細(xì)胞數(shù)量。未加丁酸鈉的A1細(xì)胞在第3天和第7天G1期占比為36.836%和34.913%，第3天A2～A5組G1期細(xì)胞均在60%左右，直至第7天培養(yǎng)結(jié)束，G1期細(xì)胞占比略有減少；較高濃度（2.0，4.0 mmol／L）的丁酸鈉促使更多數(shù)量的細(xì)胞位于G1期，減少S期細(xì)胞數(shù)（圖2）。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測濃度梯度丁酸鈉作用的293F細(xì)胞周期

2.3 丁酸鈉與Feed聯(lián)合作用提高293F細(xì)胞的抗體產(chǎn)量

盡管用丁酸鈉處理后活細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步下降，第7天收獲抗體檢測產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，1.0 mmol／L丁酸鈉+5% Feed培養(yǎng)的A3組細(xì)胞表達(dá)的PD-1單抗產(chǎn)量達(dá)到最高值57.4 mg／L，明顯高于A1、A2組（P均＜0.05）；進(jìn)一步提高丁酸鈉濃度，抗體產(chǎn)量有所減少，2.0 mmol／L和4.0 mmol／L丁酸鈉作用下抗體產(chǎn)量為43.2 mg／L和32.7 mg／L；不加Feed的B組細(xì)胞抗體分泌量遠(yuǎn)低于添加的A組，產(chǎn)量最高的A3組因補(bǔ)充了Feed，抗體表達(dá)量較未加Feed的B3組明顯增加（t＝7.1，P＜0.01）；其中B1組未加丁酸鈉和Feed，最終收獲PD-1抗體僅為7.1 mg／L，約是最高產(chǎn)量的1／8。見圖3。

2.4 丁酸鈉與Feed聯(lián)合應(yīng)用對PD-1嵌合抗體識別抗原位點鑒定和抗體效價的影響

取A1～A5培養(yǎng)上清液，經(jīng)純化獲得的PD-1嵌合抗體均能識別表達(dá)于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株L929／PD-1表面的PD-1分子；5組抗體稀釋一定倍數(shù)后，當(dāng)濃度為0.5μg／mL時，不加丁酸鈉的A1組細(xì)胞表達(dá)的嵌合抗體與L929／PD-1結(jié)合的陽性率有所下降，低于其他4組；相同條件下A2～A5組細(xì)胞的結(jié)合率不變，仍然保持在90%以上（圖4）。由此表明，添加丁酸鈉對PD-1嵌合抗體的效價有一定的影響。

圖3 添加丁酸鈉和CHO CD Efficient Feed對293F細(xì)胞抗體產(chǎn)量的影響

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測PD-1嵌合抗體特異性識別轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/PD-1表面PD-1分子

3 討論

丁酸鈉是一種天然小分子，作用于細(xì)胞周期影響細(xì)胞生長和分化。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉，尤其是穩(wěn)定存在于體內(nèi)的另一種類似物三丁酸甘油酯，是DNA有效合成和細(xì)胞增殖的抑制劑［17］。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，丁酸鈉可通過誘導(dǎo)G0／G1期阻滯和細(xì)胞凋亡從而抑制細(xì)胞生長與增殖［18］，其機(jī)制在于丁酸鈉可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶及其抑制劑，二者都是參與G1期細(xì)胞周期調(diào)控的重要蛋白［19］。研究證實，丁酸鹽下調(diào)小鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白（cyclin）D1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)；對豬上皮細(xì)胞的作用則與cyclin D1相反，丁酸鈉增加cyclin D3蛋白的表達(dá)水平，隨著cyclin D3表達(dá)上調(diào)，cyclin D1表達(dá)降低，該現(xiàn)象與G0／G1期細(xì)胞周期阻滯密切相關(guān)［20］。上述研究表明，丁酸鈉誘導(dǎo)包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞系的G1期細(xì)胞周期阻滯；這種G1期阻滯效應(yīng)表明，為了通過G1期進(jìn)入DNA合成S期，細(xì)胞需要具備對丁酸鈉敏感的相關(guān)基因和蛋白質(zhì)［21］。

本研究結(jié)果表明，盡管在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下加入丁酸鈉，可增加293F細(xì)胞PD-1單抗表達(dá)量，然而由于丁酸鈉對細(xì)胞生長和活性有抑制作用，與未處理的細(xì)胞相比，所有用丁酸鈉處理的活細(xì)胞數(shù)量均有所下降。因此，為了消除丁酸鈉帶來的不良反應(yīng)，在培養(yǎng)過程中使用5%Feed補(bǔ)充培養(yǎng)基消耗；與未處理的細(xì)胞相比，抗體收獲量至少增加2倍。由此可見，F(xiàn)eed對293F細(xì)胞瞬時表達(dá)PD-1抗體是必不可少的補(bǔ)充劑，同時隨著丁酸鈉濃度進(jìn)一步提高至2.0 mmol／L和4.0 mmol／L，293F細(xì)胞增殖受到抑制，PD-1抗體產(chǎn)量開始減少。Feed在無血清培養(yǎng)基的穩(wěn)定性低于有血清培養(yǎng)基，利用丁酸鈉和Feed有利于細(xì)胞生長和蛋白產(chǎn)生的優(yōu)勢，因此本研究在培養(yǎng)后第1天添加丁酸鈉，第1，3，5天補(bǔ)充Feed，觀察二者對抗體表達(dá)的聯(lián)合效應(yīng)。丁酸鈉和Feed聯(lián)合培養(yǎng)的293F細(xì)胞抗體產(chǎn)量高于單獨使用丁酸鈉或Feed，且最佳濃度為加入1.0 mmol／L丁酸鈉和5% Feed，此時抗體產(chǎn)量最高。本研究可能對大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)治療性抗體藥物具有一定的參考價值。