崔詩遙，曾 鵬，郎明紫，解鴻青，陳亞潔，李聰慧，沈張飛，李有貴，時連根＊

（1.浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021）

桑黃（Phellinus baumii）俗稱桑耳、桑寄生，是一種珍貴的藥用真菌，因寄生于桑樹而得名，有“森林黃金”之美稱。桑黃在我國作為名貴中藥材入藥已有2000多年歷史，遠(yuǎn)在戰(zhàn)國時期的《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有“桑黃久服輕身不老延年”的記載。桑黃味微苦，性寒，中醫(yī)認(rèn)為其利五臟、軟堅、排毒、止血等，可用于治療血淋、血崩、脫肛瀉血、帶下、經(jīng)閉、脾虛泄瀉等［1，2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，桑黃含有多糖類、黃酮類、萜類等多種活性成分，臨床用于調(diào)節(jié)機體免疫、延緩衰老、抗腫瘤、保肝護肝、降血糖、抗炎癥等［3，4］。但桑黃的藥理作用機理沒有被很好研究，這阻礙了桑黃藥用水平提高與藥用范圍擴大。本文通過桑黃主要活性成分多糖的抗DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基、抗羥基自由基（·OH）和還原力試驗，研究桑黃多糖的體外抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 供試桑黃及主要試劑和儀器

桑黃子實體由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所提供，經(jīng)干燥粉碎后過80目篩，于4℃存儲備用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）為Sigma公司產(chǎn)品；FeSO4、雙氧水（H2O2）、水楊酸、無水乙醇、維生素C、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3等化學(xué)試劑均為分析純，購自中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司；D101大孔樹脂購自天津興南允能高分子技術(shù)有限公司。

UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津公司）；CR22GⅢ高速冷凍離心機（日本日立公司）；YQ-1002C型超聲波清洗儀（上海易凈超聲波儀器有限公司）；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品）；QT-80FC自動部分收集器（上海琪特分析儀器廠）；free zone 6 plus冷凍干燥機（Labconco公司）。

1.2 桑黃多糖的提取與純化

提取采用超聲波輔助乙醇浸提法［5］。稱取桑黃子實體粉末，按照1∶26料液比（質(zhì)量體積比，g/mL）加入雙重蒸餾水，混勻后，在30℃下用超聲波清洗儀以500 W功率53 KHz頻率的超聲波場作用30 min，然后于100℃水浴中回流提取3次，合計提取時間4.35 h，每次提取后進行抽濾處理，并將濾液于10000 rpm離心5 min，取上清液。合并3次上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到桑黃多糖粗提液。

純化采用依次過DEAE離子交換柱、Sephacryl S400凝膠柱、Sephacryl S200凝膠柱的方法［6］。取桑黃多糖粗提液過0.45 mm濾膜，先上DEAE離子交換柱，用0.1 M NaCl液洗脫，再上Sephacryl S400凝膠柱，用蒸餾水洗脫，最后上Sephacryl S200凝膠柱，用蒸餾水洗脫，自動收集器收集多糖洗脫液，-50℃下真空干燥，得到純一桑黃多糖，用于體外抗氧化試驗。

1.3 抗DPPH自由基活性測定

參考Hsu等（2006）報道的方法［7］。取不同濃度桑黃多糖溶液（用蒸餾水配制）2 mL，加入等體積的0.04 mmol/L DPPH溶液（用95%乙醇配制），混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min，3000 r/min離心10 min，取上清液在517 nm下測定吸光度，試驗重復(fù)三次，以維生素C為陽性對照，按下公式計算DPPH清除率：

DPPH清除率（%）=［A3-（A1-A2）］/A3×100%，式中A1為2 mL桑黃多糖+2 mL DPPH的吸光值；A2為2 mL桑黃多糖+2 mL95%乙醇的吸光值；A3為2 mL蒸餾水+2 mL DPPH的吸光值。

1.4 抗羥其自由基活性測定

參照Smirnoff等（1989）報道的方法［8］。取用蒸餾水配制的不同濃度桑黃多糖溶液1 mL，加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL，混勻后加入6 mmol/L H2O2溶液1 mL，混勻后靜置10 min，加入6 mmol/L水楊酸1 mL，混勻后37℃水浴反應(yīng)30 min，3000 rpm離心10 min，取上清液于510 nm處測量吸光值A(chǔ)i，以蒸餾水替換桑黃多糖液作為陰性對照組，以蒸餾水替換水楊酸作為空白對照組，以維生素C為陽性對照組，試驗重復(fù)三次，按下公式計算羥基自由基清除率：

羥基自由基清除率（%）=［A0-（Ai-Aj）］/A0×100%，式中Ai為桑黃多糖組吸光值；A0為陰性對照組吸光值；Aj為空白對照組吸光值。

1.5 還原能力測定

參考李慎新等（2008）［9］的方法。用蒸餾水配制不同濃度的桑黃多糖溶液，取桑黃多糖液0.75 mL，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）0.75 mL和1%鐵氰化鉀溶液0.75 mL，混勻后于50℃的水浴鍋中反應(yīng)20 min，再加入10%三氯乙酸溶液0.75 mL，混勻后于3000 rpm離心10 min，取上清液1.5 mL，依次加入蒸餾水1.5 mL和0.1%FeCl3溶液0.1 mL，混勻，于700 nm下測定吸光值，吸光值越高則代表該化合物還原能力越強，試驗重復(fù)三次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel和SPSS v20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，處理間差異采用LSD（Least Significant Difference）法比較，顯著性水平P＜0.05，極顯著水平P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃多糖對DPPH自由基的清除作用

測定桑黃多糖對DPPH自由基的清除作用，結(jié)果如表1所示。表1顯示，桑黃多糖對DPPH自由基的清除率隨著多糖濃度的增大而逐漸升高，表現(xiàn)較好的量效關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R2=0.9955）；陽性對照維生素C對DPPH自由基的清除率高于桑黃多糖，表現(xiàn)出很強的清除作用。結(jié)果表明，桑黃多糖對DPPH自由基具有較強的清除作用。

表1 桑黃多糖抗DPPH自由基的活性Table 1 Anti-DPPH Function of PBPP

2.2 桑黃多糖對羥基自由基的清除作用

檢測桑黃多糖對羥基自由基（·OH）的清除作用，結(jié)果桑黃多糖對羥基自由基的清除率隨著多糖濃度的增大而升高，濃度與清除率間表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R2=0.9770）；桑黃多糖對羥基自由基的清除率低于陽性對照維生素C（表2）。結(jié)果表明，桑黃黃酮對羥基自由基表現(xiàn)出較好的清除作用。

表2 桑黃多糖的抗羥自由基活性Table 2 Anti-hydroxyl Radical Function of Pbpp

2.3 桑黃多糖的還原能力

從表3可知，桑黃多糖的總還原力隨著多糖濃度的增大而逐漸升高，并且表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R2=0.9798）；桑黃多糖的還原力在低濃度（0.05 mg/mL）時基本與陽性對照維生素C的相近，隨著濃度的升高，其還原力低于維生素C的幅度逐漸拉大。結(jié)果表明，桑黃多糖具有較強的還原能力。

表3 桑黃多糖的還原能力Table 3 Reducion Ability of Pbpp

3 討論

多糖是除蛋白質(zhì)和核酸以外的另一類重要生物大分子，廣泛存在于植物、動物和微生物中，具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、降血糖、抗炎、抗癌、抗氧化防衰老等廣泛的藥理作用，而且毒副作用極小，所以成為當(dāng)今醫(yī)藥研究與應(yīng)用的熱點［10］。多糖種類繁多，不同有機體中存在不同種類與結(jié)構(gòu)的多糖，即表現(xiàn)出不同的藥理作用。本試驗從總還原力、DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率這三個方面，檢測了桑黃多糖的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)桑黃多糖具有良好的體外抗氧化性能，研究結(jié)果豐富了桑黃的基礎(chǔ)藥理學(xué)，并為桑黃多糖的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供了理論依據(jù)。

DPPH是一種非常穩(wěn)定的自由基，在515 nm處有特征性吸收，當(dāng)孤對電子被中和后，DPPH的深紫色變淺或消失，所以常用于物質(zhì)抗氧化活性的體外檢測［11］。羥基自由基（·OH）是活性最強的一種自由基，能誘導(dǎo)膜系統(tǒng)的氧化損傷，從而危害生物體，誘發(fā)腫瘤、糖尿病、高血壓等疾病，促進機體衰老［12］。還原力是反映一種物質(zhì)抗氧化能力的一個很重要的指標(biāo)，它能夠反映此物質(zhì)的供電子能力，進而反映出此物質(zhì)的抗氧化活性［13，14］。本研究發(fā)現(xiàn)，桑黃多糖具有較強的還原力以及對DPPH自由基和羥基自由基的清除能力，并且其還原力和自由基清除能力與其濃度呈量效關(guān)系，顯示出良好的體外抗氧化作用。盡管桑黃多糖抗氧化活性弱于陽性對照維生素C，但在一定濃度范圍內(nèi)能夠抑制自由基引起的氧化損傷，這對于離體大面積篩選抗氧化藥物有一定的價值。體外抗氧化作用只反映出抗氧化性能的一個方面，所以要全面了解桑黃多糖的抗氧化性能，還需要結(jié)合體內(nèi)外動物模型以及更多技術(shù)指標(biāo)來進行全面完整的評價，此方面的工作有待深入研究。