張 琛 許慧卿 崔桂友 丁香麗 胡 艦 李 波 于小番

(揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪·食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

嘔吐毒素又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON, 3, 7, 15-三羥基-12, 13-環(huán)氧單端孢霉-9烯-8酮)，是由禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum產(chǎn)生的重要真菌毒素[1-2]。嘔吐毒素在小麥、玉米和大豆等常規(guī)糧食中普遍存在，是食品和飼料原料中僅次于黃曲霉毒素的最常見的真菌毒素之一，在全球范圍內(nèi)有著較高的污染率[3]。嘔吐毒素可通過食物鏈對人畜造成很大的危害，能引起動物嘔吐、腹瀉、皮膚刺激、拒食、神經(jīng)紊亂、流產(chǎn)、死胎等[4-6]。

目前常用的嘔吐毒素脫毒方法有物理、化學(xué)和生物法。由于DON的結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定[7]，物理和化學(xué)方法脫毒效果不穩(wěn)定，同時會破壞食物原料中的營養(yǎng)成分，還容易造成二次污染[8-11]，而微生物降解毒素的方法因其高效環(huán)保而受到廣泛的關(guān)注，并且有較好的脫毒效果[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)動物腸道的混合微生物菌團(tuán)對DON的降解率可接近50%[14-15]，霉菌屬的某些菌株可達(dá)到65%以上[16]，芽孢桿菌屬中的某些菌株甚至可達(dá)80%以上[17-18]。

雖然上述微生物降解法對DON降解取得了較好的效果，但也存在諸多缺陷。早期研究[15,19-20]發(fā)現(xiàn)，能降解DON的微生物大多是源于動物腸道的混合菌群不能進(jìn)行純培養(yǎng)，混合物也不適合進(jìn)行規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)；雖然有部分菌株經(jīng)純化后可降解DON，但大多數(shù)研究[16-17,21]都是用單株菌直接與DON標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗，沒有驗證其在食物環(huán)境中對DON的降解效果，甚至部分能降解DON的菌株本身就是致病菌、致敏源，存在安全隱患。這些問題直接影響微生物降解法在實踐中的應(yīng)用。

為探明真菌毒素生物降解的機(jī)制和安全有效的途徑，本試驗擬通過研究益生菌納豆芽孢桿菌Bacillusnatto16-1的菌懸液、發(fā)酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液及細(xì)胞壁懸浮液對小麥粉中的嘔吐毒素降解效果，并利用高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)對作用結(jié)果進(jìn)行分析，來探討納豆芽孢桿菌不同處理方式對嘔吐毒素的脫毒能力，為真菌毒素生物降解的實踐應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌Bacillusnatto16-1(Bn16)：由本實驗室選育保藏；

嘔吐毒素(DON)：美國Sigma公司；

甲醇、氯化鈉：分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司；

營養(yǎng)肉湯：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH為7.4，121 ℃高壓滅菌20 min；

電子天平：GL124-1SCN型，德國Sartorius公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1F型，蘇州凈化有限公司；

全自動滅菌鍋：JF-SX-500型，日本TOMY公司；

超純水儀系統(tǒng)：Millipore Direct 8型，美國Millipore公司；

冷凍離心機(jī)：AllegraX-22R型，美國Beckman Coulter公司；

大容量雙層培養(yǎng)搖床：KYC-1102型，新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

超聲破細(xì)胞破碎儀：JY920-IID型，新芝生物科技股份有限公司；

酶標(biāo)分析儀：ZM-560型，中德伯爾生物技術(shù)有限公司；

液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1200-6460 QQQ型，美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液及發(fā)酵上清液的制備 取穩(wěn)定生長期(28～38 h)Bn16發(fā)酵液，調(diào)節(jié)菌體濃度至1×1012CFU/mL，然后進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別獲得濃度為1×1012(高濃度)，1×1011(中濃度)，1×1010(低濃度)CFU/mL 3組菌液。將各濃度Bn16發(fā)酵液于8 000 r/min離心10 min，分別收集菌體和上清液。菌體用無菌生理鹽水洗滌3次后，再用生理鹽水重懸至原菌體濃度，分別記為高、中、低濃度菌懸液。上清液分別用0.22 μm濾膜(Milipore)過濾，濾液即為高、中、低3個濃度組的發(fā)酵上清液。菌懸液和上清液分別于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 全菌裂解液及細(xì)胞壁懸浮液的制備 按1.2.1制備Bn16高、中、低濃度菌懸液，反復(fù)凍融后，用超聲波細(xì)胞破碎儀(輸出功率400 W，間隔時間10 s，每次裂解時間10 s，裂解總時間20 min，保護(hù)溫度0 ℃)對菌懸液進(jìn)行裂解并用顯微鏡檢查裂解效果，再經(jīng)過濾后收集濾液，然后4 ℃，10 000 r/min離心15 min，分別收集濾液，即為高、中、低濃度的全菌裂解液。對各組沉淀進(jìn)行洗滌并重懸至原溶液體積，即為高、中、低濃度的細(xì)胞壁懸浮液。全菌裂解液和細(xì)胞壁懸浮液分別于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶液的粗提取 按1.2.1制備Bn16高、中、低濃度發(fā)酵液，于4 ℃，12 000 r/min離心20 min，上清液分別用0.45 μm的微孔濾膜過濾[22]，收集濾液，即為高、中、低濃度的粗提酶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 小麥粉樣品制備 取市售小麥粉，測定DON含量，面粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇特征值為(2 366±187) μg/kg[23]，根據(jù)測定結(jié)果適量添加DON標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)節(jié)小麥粉中的DON含量[約為(2.6±0.1) μg/g]，使小麥粉樣品中的DON含量大于特征值，滅菌，40 ℃干燥至恒重。

1.2.5 菌體成分對小麥粉中DON的降解 分別取高、中、低濃度的菌懸液、發(fā)酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液、細(xì)胞壁懸浮液，與上述含有DON的小麥粉樣品按5∶1(mL/g)混合；以添加等體積生理鹽水小麥粉作空白對照，于35 ℃，140 r/min孵育發(fā)酵，分別在第5，10 h(穩(wěn)定期中期和穩(wěn)定期末期)取樣并測定樣液中DON殘留量。

1.2.6 小麥粉中DON殘留濃度的檢測 按GB 5009.111—2016進(jìn)行操作。用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測樣品中DON殘留量，每組設(shè)置3個平行。

參照吳娛等[22]的研究方法，經(jīng)甲醇粗提乙腈復(fù)提后，利用高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS)對降解產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel、ELISA Calc、SPSS等軟件進(jìn)行計算和統(tǒng)計分析。

Bn16對DON的脫毒效果用清除率表示，按式(1)計算：

(1)

式中：

（2）跟蹤、追究不嚴(yán)格。高校審計處根據(jù)審計結(jié)果出具審計報告，對內(nèi)部控制設(shè)計和執(zhí)行情況有針對性地提出改善對策和建議，并要求整改。但是內(nèi)部審計部門出具完審計報告后，跟蹤及追究力度不夠，加之相關(guān)部門對審計結(jié)果疏于重視，未能及時堵住漏洞，導(dǎo)致風(fēng)險依舊存在，嚴(yán)重影響了內(nèi)部控制實施的有效性。

CL——DON清除率，%；

w0——對照組樣品中DON含量，μg/10 g；

w1——處理樣中DON殘留量，μg/10 g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度納豆芽孢桿菌Bn16菌懸液對DON的脫毒效果

不同濃度的Bn16菌懸液對小麥粉樣品中DON的脫毒效果如表1所示。

由表1可以看出，小麥粉與不同濃度的Bn16菌懸液孵育后，其中的DON濃度均有不同程度的下降，下降的幅度與菌懸液濃度、孵育時間有關(guān)。不同濃度處理組的DON清除率均達(dá)到53%以上，其中經(jīng)過10 h孵育后各處理組的DON降解率均達(dá)到57%以上。處理10 h不同濃度處理組間清除率并無顯著差異，但不同處理時間對各處理組的DON清除率存在顯著差異，隨處理時間的延長，盡管清除率有所提高，降解速率明顯減緩。以上結(jié)果表明，Bn16菌懸液對小麥粉中的DON毒素具有較好的清除作用，這種清除作用在一定時間內(nèi)與菌濃度有關(guān)。

目前，嘔吐毒素的生物脫毒已成為國內(nèi)外研究的熱點。許多微生物，如酵母菌等真菌和某些細(xì)菌均可用于去除或減少食品中的嘔吐毒素。Yu等[19]從雞的腸道內(nèi)容物中分離到的芽孢桿菌(Bacillus)可在無氧條件下將DON轉(zhuǎn)化為低毒性的去環(huán)氧化合物dE-DON，Li等[24]通過動物試驗證實芽孢桿菌對DON具有降解作用。本試驗中不同濃度的納豆芽孢桿菌Bn16菌懸液對DON均具有一定的清除作用，說明納豆芽孢桿功具有生物降解DON的能力。納豆芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，是枯草芽孢桿菌的一個亞種，自身無致病性，可降解一些復(fù)雜的碳水化合物。Bn16對DON的清除機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.2 不同濃度納豆芽孢桿菌Bn16發(fā)酵上清液對DON的脫毒效果

不同濃度的Bn16發(fā)酵上清液對小麥粉樣品中DON的脫毒效果如表2所示。

2.3 納豆芽孢桿菌Bn16全菌裂解液對DON的脫毒效果

不同濃度的Bn16裂解液對小麥粉樣品中DON的脫毒效果如表3所示。

由表3可以看出，小麥粉與不同濃度的Bn16裂解液經(jīng)過5 h孵育后，DON的清除率達(dá)到56%以上，經(jīng)過10 h 孵育后全菌裂解液對DON清除率最高可達(dá)58.59%。10，5 h處理組之間存在顯著差異，但同一處理時間的不同濃度處理組之間差異不顯著。以上結(jié)果表明，Bn16的胞內(nèi)可能含有可清除DON的物質(zhì)，但是在試驗濃度下，這些物質(zhì)對DON的清除作用與時間有關(guān)，而與菌裂解液濃度無關(guān)。

表1 不同濃度Bn16菌懸液對DON的脫毒效果?

? 不同小寫字母表示各試驗組間差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

表2 不同濃度Bn16發(fā)酵上清液對DON的脫毒效果?

? 不同小寫字母表示各試驗組間差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

表3 不同濃度Bn16全菌裂解液對DON的脫毒效果?

? “-”表示DON清除率為0%。

全菌裂解液主要成分是Bn16細(xì)胞器、胞內(nèi)酶等大分子物質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中一些小分子物質(zhì)的混合物，各種物質(zhì)對DON的清除作用可能處于一個相互制約的過程，因此雖然DON的清除率隨著裂解液濃度的增加而增加，但增加的量并未達(dá)到顯著水平。

2.4 不同濃度納豆芽孢桿菌Bn16粗提酶液對DON的脫毒效果

不同濃度的Bn16粗提酶液對小麥粉樣品中DON的脫毒效果如表4所示。

由表4可以看出，小麥粉與不同濃度的Bn16粗提酶液孵育后，DON的清除率均達(dá)到62%以上，經(jīng)過10 h孵育后不同濃度的粗提酶液對DON清除率均有所提高，但增幅較小，各濃度組之間均沒有顯著差異。以上結(jié)果表明，Bn16胞外酶對小麥粉中的DON有清除作用，作用效果與DON和酶的作用時間有關(guān)。

粗提酶液中主要成分為Bn16的胞外酶，包括脂肪酶和蛋白酶等。研究[25-27]發(fā)現(xiàn)真菌中的蛋白酶和脂肪酶等胞外酶類能通過打開DON結(jié)構(gòu)中的環(huán)氧鍵或水解DON來降解DON。同時，酶液中可能會有一些其他因子，比如酶的抑制劑一起濾過，在高濃度情況下，酶的抑制劑濃度也高，所以高濃度組在10 h時反而增加不明顯。同時，高濃度組由微生物的生長代謝導(dǎo)致的pH值的變化也更明顯，因此對酶活性的影響也比較大。

2.5 不同濃度納豆芽孢桿菌Bn16細(xì)胞壁懸液對DON的脫毒效果

不同濃度的Bn16細(xì)胞壁懸液對小麥粉樣品中DON的脫毒效果如表5所示。

表4 不同濃度Bn16粗提酶液對DON的降解效果?

? “-”表示DON清除率為0%。

表5 不同濃度Bn16細(xì)胞壁懸液對DON的脫毒效果?

? “-”表示DON清除率為0%。

由表5可以看出，小麥粉不同濃度的Bn16細(xì)胞壁懸液經(jīng)過5 h孵育后，DON清除率均達(dá)61.7%以上，且各組清除率無差異；處理10 h后的檢測結(jié)果顯示，中、低濃度的細(xì)胞壁懸液對DON清除率有所提高，但高濃度則略有下降；這可能與細(xì)胞壁懸液的濃度及細(xì)胞壁破碎程度有關(guān)。以上結(jié)果表明，Bn16的細(xì)胞壁可降低小麥粉中的DON的含量，作用效果與細(xì)胞壁濃度關(guān)系不大，只在一定濃度下，清除效果會隨著時間的延長而增加。

目前研究發(fā)現(xiàn)，真菌類和一些革蘭氏陽性菌對DON均有吸附作用，這與本試驗的結(jié)果基本一致。這種吸附作用是可逆的，因此對吸附時間，吸附劑濃度及穩(wěn)定性有較高要求。

2.6 不同處理方式DON的脫毒效果比較

Bn16不同細(xì)胞成分對小麥粉中的DON的清除效果如表6所示。

由表6可以看出，同一細(xì)胞成分與小麥粉混合后，作用10 h后DON的清除率均明顯高于作用5 h的處理，而相同作用時間不同處理濃度之間的差異較小。比較處理10 h后各濃度組的DON清除率，除發(fā)酵上清液處理外，其他各組的高濃度組處理效果并不優(yōu)于中濃度組，說明中濃度組清除DON的能力已接近飽和。比對不同處理的納豆芽孢桿菌Bn16對DON的清除率發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)胞成分對小麥粉中DON的清除效果有明顯的差異，其中粗提酶液與細(xì)胞壁懸浮液對DON的清除率顯著高于其他細(xì)胞成分處理組，有可能這是Bn16清除DON的2個主要途徑。菌懸液對DON的清除率與細(xì)胞壁懸浮液處理相比，存在著較為明顯的差異。說明Bn16對DON的吸附作用并不完全存在于細(xì)胞外膜，可能細(xì)胞外膜內(nèi)側(cè)或內(nèi)膜還存在著某些物質(zhì)，它們對DON有一定的吸附作用。

表6 Bn16不同細(xì)胞成分對DON的清除率?

? 不同小寫字母表示同列處理組之間有顯著差異(P<0.05)；不同大寫字母表明同行處理組之間有顯著差異(P<0.05)。

以上結(jié)果表明，不管從處理成本還是處理效果來看，中濃度的粗提酶液或細(xì)胞壁懸浮液處理10 h對DON清除均能達(dá)到較好的效果。

2.7 不同處理方式對DON影響結(jié)果比較

采用LC-MS對不同處理組的作用底物進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，DON標(biāo)準(zhǔn)品的相對分子質(zhì)量為293.30，經(jīng)過Bn16菌懸液、全菌裂解液、粗提酶液的作用后均產(chǎn)生了相對分子質(zhì)量為277，283左右的新物質(zhì)；經(jīng)發(fā)酵上清液處理后的樣品只有分子質(zhì)量283左右的新物質(zhì)產(chǎn)生，而細(xì)胞壁處理組并無新的物質(zhì)產(chǎn)生。以上結(jié)果表明，納豆芽孢桿菌清除DON的機(jī)制可能包括生物吸附和生物降解，酶等大分子物質(zhì)通過生物降解產(chǎn)生2種不同的降解產(chǎn)物，而細(xì)胞壁對DON的清除可能只是通過細(xì)胞壁成分的吸附作用。本研究中所用的菌懸液并未滅活，因此在5～10 h的作用中，Bn16有可能產(chǎn)生少量酶等胞外物質(zhì)，因此菌懸液處理出現(xiàn)了2種降解產(chǎn)物。

研究[28-29]證明，微生物細(xì)胞壁對DON的清除作用主要是生物吸附。它們是通過細(xì)胞壁的肽聚糖、甘露聚糖和葡聚糖等高分子物質(zhì)對DON的吸附。這與本試驗結(jié)果一致。

微生物酶可通過水解和異構(gòu)化等方式作用于DON的C-12,13環(huán)氧基團(tuán)、C-3羥基等位點進(jìn)行生物降解[14,25-27]。于大海[30]和Palomo等[31]發(fā)現(xiàn)真菌中的脂肪酶具有催化水解環(huán)氧化合物的功能，可以將DON轉(zhuǎn)化為的DOM-1。鄧露芳等[32]和Young等[33]發(fā)現(xiàn)DON生物降解的另一條途徑可能是微生物蛋白酶在堿性條件下DON結(jié)構(gòu)中的C12/C13環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生去環(huán)氧化。本試驗中，納豆芽孢桿菌Bn16的粗提酶液處理降解DON后可產(chǎn)生2種產(chǎn)物，但其作用機(jī)制究竟是將DON結(jié)構(gòu)中的環(huán)氧鍵被打開生成2個羥基，還是通過去環(huán)氧化達(dá)到水解DON的目的，有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本試驗通過研究納豆芽孢桿菌Bacillusnatto16-1各細(xì)胞成分對小麥粉中DON的清除能力發(fā)現(xiàn)，菌懸液、發(fā)酵上清液，粗提酶液、全菌裂解液和細(xì)胞壁均有清除DON的能力，其中微生物酶和細(xì)胞壁是清除DON的主要細(xì)胞成分，用1×1011的菌懸液制得的粗提酶液或細(xì)胞壁懸浮液與小麥粉樣品按5∶1(g/mL)混合后處理10 h對小麥粉中DON清除能達(dá)到較好的效果。同時，本試驗證實了細(xì)胞壁和微生物酶類可通過不同的機(jī)制清除DON，但對于不同微生物酶降解的DON機(jī)制、降解產(chǎn)物以及降解產(chǎn)物的毒性尚需進(jìn)一步研究。

圖1 Bn16不同細(xì)胞成分降解DON的 LC-MS圖譜

利用生物脫毒對糧食進(jìn)行DON脫毒處理，相較物理、化學(xué)脫毒法，不但能避免脫毒處理過程中對食品原料的營養(yǎng)成分的影響，還可提高食品營養(yǎng)價值。通過研究菌體成分對DON的清除作用，可以克服全菌脫毒效果不穩(wěn)定的局限，也可以突破因細(xì)菌特殊氣味導(dǎo)致的接受程度低的限制，應(yīng)用更加廣泛。因此，研究微生物降解毒素的機(jī)制，尋找降解毒素的有效成分進(jìn)行純化分離以及進(jìn)一步的改造，將是未來一段時間內(nèi)真菌毒素生物降解的研究方向。