張 強，陳笑南，田灣灣，梁 軍，李鵬躍，杜守穎

（北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029）

復方丹參制劑作為《中國藥典》收載的名優(yōu)中成藥，可用于氣滯血瘀所致的胸痹，癥見胸悶、心前區(qū)刺痛及冠心病心絞痛見上述癥狀者[1]。復方丹參方由丹參、三七、冰片配伍組成，其中丹參為君藥。由于復方丹參方中各有效成分存在體內(nèi)溶出困難、口服吸收較差、胃腸道內(nèi)不穩(wěn)定的問題[2]，因此本課題組將其劑型優(yōu)化為黏附微丸，以期增加復方丹參制劑在體內(nèi)的滯留時間，提高其生物利用度。結(jié)合實驗室前期研究[3-4]，本實驗進一步以丹參酮ⅡA為代表的脂溶性成分為研究對象，對比不同工藝制備的3種不同復方丹參微丸 [冰片包合復方丹參黏附微丸（BI-FDAP）、冰片不包合復方丹參黏附微丸（BE-FDAP）、普通微丸（FDP）]中隱丹參酮與丹參酮ⅡA的體外溶出度，評價復方丹參黏附微丸的緩釋作用。

1 材料

1.1 試藥 FDP、BI-FDAP、BE-FDAP（實驗室自制），隱丹參酮對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號：111562-201212），丹參酮ⅡA 對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號：110745-201318），乙腈（美國 Fisher公司，色譜級），磷酸[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，色譜級]，純凈水（杭州娃哈哈集團），其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 LC-20AD型高效液相色譜（HPLC）儀（PDA檢測器，日本島津公司），Sartorius BS 110S型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司），KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），ZRS-8G智能溶出儀（天津天大天發(fā)儀器公司），SHB-型水循環(huán)多用真空泵（上海振捷實驗室設備有限公司）。

2 方法

2.1 復方丹參微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脫：0～10 min，61%～80%A；10～20 min，80%A；20～25 min，80%～61%A。進樣量為 10 μL，檢測波長270 nm，流速為1 mL/min，柱溫25℃。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取隱丹參酮4.21 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，濃度為0.421 g/L；精密稱取丹參酮ⅡA 5.24 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，濃度為0.524 g/L。分別精密移取隱丹參酮、丹參酮ⅡA 2 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即為混合對照品溶液。

2.1.3 黏附微丸供試品（BI-FDAP與BE-FDAP）溶液的制備 復方丹參黏附微丸研細過80目篩，備用。精密量取5 mL去離子水置于100 mL具塞錐形瓶中，精密稱取過篩粉末0.1 g，均勻撒在溶液表面，溶脹6 h，精密量取5 mL甲醇至錐形瓶中，稱取質(zhì)量，超聲5 min，重復上述過程3次，第4次加入甲醇后超聲30 min，稱取質(zhì)量，補足失重。取5 mL上清液置于離心管中，9 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm濾膜。

2.1.4 FDP供試品溶液的制備 精密稱取微丸細粉（過80目篩）0.1 g，移取25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲30 min，甲醇補足失重，上清液過0.45 μm濾膜。

2.1.5 方法學考察 1）專屬性考察：按照“2.1”項下色譜條件分別檢測混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，色譜圖見圖1，表明該方法專屬性良好。2）線性關系考察：精密吸取對照品儲備液，加甲醇稀釋配制成系列不同濃度的對照品溶液，測定峰面積。以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并列回歸方程分析。隱丹參酮的回歸方程為：Y?=38 201X+9 462.9，r=0.999 9。丹參酮ⅡA 的回歸方程為Y?=45 222X+14 337，r=0.999 9。表明隱丹參酮在 1.648 μg/mL～84.2 μg/mL、丹參酮ⅡA 在2.096～104.8 μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。3）精密度考察：取混合對照品溶液連續(xù)進樣6次，測定峰面積，隱丹參酮與丹參酮ⅡA的RSD值為0.48%和0.42%，表明儀器的精密度良好。4）穩(wěn)定性考察：取復方丹參黏附微丸與FDP供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12 h 測定峰面積。隱丹參酮與丹參酮ⅡA的RSD值均低于3.0%，表明兩種成分在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。5）重復性考察：分別按照“2.3”與“2.4”項下供試品溶液制備方法，平行制備6份復方丹參黏附微丸與FDP的供試品溶液，測定隱丹參酮與丹參酮ⅡA的峰面積，計算RSD值。隱丹參酮RSD值分別為3.51%、2.03%、0.37%，基本符合要求。丹參酮ⅡA的RSD值分別為3.14%、1.44%、0.61%，基本符合要求。6）加樣回收率考察：取復方丹參微丸研細，過80目篩，備用。精密量取5 mL水置于100 mL具塞錐形瓶中，精密稱取過篩粉末0.05 g，均勻撒在溶液表面，溶脹6 h，精密量取5 mL混合對照品甲醇溶液至錐形瓶中，按照供試品溶液制備方法進行操作，隱丹參酮的回收率分別為95.51%、98.34%；丹參酮ⅡA的回收率分別為96.12%、106.15%，均符合要求。

圖1 復方丹參微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA色譜圖Fig.1 Chromatogram of cryptotanshinone and tanshinoneⅡA in Fufang Danshen Pellets

2.2 復方丹參微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA含量測定 按照“2.1”項下建立的含量測定方法分別測定BI-FDAP、BE-FDAP以及FDP中隱丹參酮與丹參酮ⅡA的含量。

2.3 復方丹參微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA溶出度研究

2.3.1 復方丹參微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA累積溶出度的研究 實驗采用2015版《中國藥典》四部溶出度與釋放度測定法第一法進行測定[5]。精密稱定復方丹參微丸0.8 g，以0.2%十二烷基硫酸鈉緩沖液（pH為6.8）為溶出介質(zhì)，體積為500 mL，轉(zhuǎn)速為 100 r/min，溫度（37.0±0.5）℃。分別在 0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、14 、24 h 取樣 1.5 mL，加0.5 mL乙腈渦旋3 min混合均勻，0.45 μm濾膜過濾，每次取樣后補加1.5 mL同溫度溶出介質(zhì)，HPLC測定，計算累積釋放度。2.3.2 復方丹參微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA累積溶出度的計算 累積溶出度的計算方法：Qn=500×；累積溶出百分率 （%）=×100%。式中Qn為第n點的累積含量（μg），Cn為第n點測得的藥物質(zhì)量濃度（μg/mL），Ci為第i（i≤n-1）個取樣點測得的溶出液中藥物質(zhì)量濃度。

以時間為橫坐標，累積溶出度為縱坐標，繪制溶出度曲線。

選擇3種溶出動力學模型方程：零級方程、Higuchi方程、Peppas方程，其方程見表1。

表1 擬合模型及方程Tab.1 Fitting models and equations

t表示釋藥時間，Mt（mg）代表在t時間點累積釋藥量，M∞（mg）為最大藥物累積釋放量，Mt/M∞為t時累積釋放率。式中k為藥物釋放速率常數(shù)，式中n表示釋藥參數(shù)。Higuchi方程認為藥物的釋放是基于Fick’s定律的擴散過程（即Fickian擴散），藥物從基質(zhì)中的釋放遵循每單位面積的釋藥量與時間的平方根成正比；Ritger-Peppas模型中，可根據(jù)n分析成分的釋放機制。Peppas方程中n＜0.43，符合Fickian 擴散釋藥機制，n＞0.85，符合溶蝕機制，0.43～0.85間，擴散和溶蝕并存。對溶出實驗數(shù)據(jù)進行溶出方程擬合，探討3種制劑中隱丹參酮與丹參酮ⅡA的體外釋藥機制。

2.3.3 3種制劑中隱丹參酮與丹參酮ⅡA相似因子分析 相似因子是根據(jù)溶出數(shù)據(jù)計算出的分析相同成分不同條件下溶出行為是否具有相似性的數(shù)據(jù)處理方式。計算公式如下Tt）2]（-0.5）×100}，其中，Rt及 Tt分別為 t時間參比及受試制劑累積溶出率，n為取點數(shù)目。

3 結(jié)果

3.1 復方丹參微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA含量測定結(jié)果 隱丹參酮與丹參酮ⅡA在3種復方丹參微丸中含量測定結(jié)果見表2。

表2 3種微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA含量測定表Tab.2 Contents of cryptotanshinone and tanshinoneⅡA in three kinds of pellets mg/g

3.2 溶出實驗結(jié)果 3種復方丹參微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA溶出曲線與最佳擬合方程見圖2。兩種黏附微丸中，隱丹參酮的溶出趨勢較為平緩，與FDP相比呈現(xiàn)出一定的緩釋作用。3種微丸中隱丹參酮的最終累積溶出度分別為（40.34±3.01）%、（42.41±1.37）%、（64.05±4.06）%。丹參酮ⅡA 在3個復方丹參制劑中溶出均比較緩慢，3種微丸的溶出曲線接近重合，BI-FDAP、BE-FDAP、FDP的累積溶出 度 分 別 為 （44.08±2.83）% 、（42.03±0.92）% 、（45.68±5.22）%，最終溶出度基本一致，溶出曲線仍呈上升趨勢。

圖2 3種微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA體外溶出曲線Fig.2 Dissolution curve of cryptotanshinone and tanshinone IIA in vitro in three kinds of pellets

溶出曲線的最佳擬合方程見表3。結(jié)果顯示，隱丹參酮在兩種黏附微丸的溶出行為更符合Higuchi方程，F(xiàn)DP中更符合Peppas模型，且n＜0.45，因此隱丹參酮在3種制劑中均符合Fickian擴散。丹參酮ⅡA在3種微丸中的溶出行為更符合Higuchi方程，屬于Fickian擴散。

3.3 相似因子分析結(jié)果 3種復方丹參微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA相似因子（f2）分析結(jié)果見表4。一般認為，f2值越接近100，相似程度就越高。當f2值在0～50時，認為兩制劑體外溶出行為有顯著性差異，f2值≥50即可認為兩者的溶出過程一致。隱丹參酮的溶出行為兩種黏附制劑更為相似，相似因子 68.31；BI-FDAP與 FDP的相似因子為 30.06；BE-FDAP與FDP的相似因子為36.36，表明隱丹參酮在黏附微丸和FDP的溶出具有明顯差異。丹參酮ⅡA在3種制劑中兩兩制劑間相似因子均大于60，BI-FDAP與BE-FDAP相似因子為60.76；BI-FDAP與FDP相似因子為76.48；BE-FDAP與FDP相似因子為63.59，3種復方丹參微丸中丹參酮ⅡA的溶出行為無差異。

表3 3種微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA溶出曲線擬合方程Tab.3 Fitting equation for the dissolution curve of cryptotanshinone and tanshinoneⅡA in three kinds of pellets

表4 3種微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA體外溶出相似因子比較Tab.4 similar factors in vitro dissolution of cryptotanshinone and tanshinone IIA in three kinds of pellets

4 討論

為了解決復方丹參制劑在體內(nèi)生物利用度低的難題，本課題組經(jīng)過劑型優(yōu)化將其制備為復方丹參黏附微丸，并對其黏附性能進行評價，表明制備的黏附微丸可以延長在體內(nèi)的滯留時間[6]。為了進一步闡明復方丹參黏附微丸的緩釋作用，實驗室前期以復方丹參片為參比制劑，分別對比冰片中龍腦、三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd及丹參中丹酚酸B、丹參酮ⅡA在復方丹參黏附微丸中的體外溶出度，同樣表明復方丹參黏附微丸具有一定的緩釋作用[3-4]。本實驗排除了片劑與微丸的干擾因素，進一步以復方丹參FDP為參比制劑，對比丹參中脂溶性成分在黏附微丸中的體外溶解度，更加準確地評價黏附微丸的緩釋作用。

由溶出實驗結(jié)果可知，3種制劑中丹參脂溶性成分隱丹參酮與丹參酮ⅡA的累積溶出度均較低，原因是由于兩者為脂溶性成分，在水中溶解度較小。因此在其溶出介質(zhì)加入十二烷基硫酸鈉以增加其在體外的溶出量，考慮十二烷基硫酸鈉為表面活性劑，液相色譜柱為十八烷基，實驗表明當測試樣品中含有表面活性劑且樣品量較大時，經(jīng)多次測定，表面活性劑會在色譜柱的篩板及硅膠的表面形成一層膜，進而影響色譜柱的效能，可能造成色譜峰變寬、拖尾等后果，為降低十二烷基硫酸鈉對色譜柱的影響，本實驗選擇了低濃度的十二烷基硫酸鈉溶出介質(zhì)（0.2%十二烷基硫酸鈉），同時樣品經(jīng)過乙腈稀釋，進一步降低樣品中十二烷基硫酸鈉的濃度。

對比的3種不同工藝制備的微丸中，丹參類脂溶性成分隱丹參酮與丹參酮ⅡA在兩種黏附微丸中的溶出曲線基本重合，其溶出行為無明顯差異。而與FDP的比較發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮的f2＜50，表明FDP與黏附微丸存在明顯的差異性，黏附微丸表現(xiàn)出明顯的緩釋作用。而丹參酮ⅡA的溶出曲線3種制劑基本重合，制劑間的f2＞50，表明FDP與黏附微丸溶出行為一致。

隱丹參酮在黏附微丸與FDP中溶出過程的差異，可能與加入的黏附材料有關。黏附制劑是指在原有制劑工藝的基礎上加入黏附材料，利用其獨特的黏附性能增加藥物在體內(nèi)的滯留時間，從而延長在體內(nèi)的吸收，提高藥物生物利用度的一種給藥系統(tǒng)[7]。課題組選定卡波姆934P、殼聚糖和羥丙基甲基纖維素（HPMC K100M）為黏附材料[8]，制備黏附微丸。這3種材料均具有一定的黏附性能，郭瑩等[9]使用卡波姆934P與乙基纖維素共同作為黏附材料制備的葛根素黏附微球生物黏附性良好。黎迎等[10]以殼聚糖作為黏附材料制備的三七總皂苷生物黏附微丸黏附性良好。上官盈盈等[11]使用羥丙基甲基纖維素制備口腔黏附片，其黏附性能良好。

丹參酮ⅡA與隱丹參酮為丹參中的脂溶性成分，而丹參酮ⅡA在黏附微丸與FDP的溶出行為比較差異不大，即黏附微丸的緩釋作用對于丹參酮ⅡA不明顯。其原因可能為丹參酮ⅡA本身的溶出較困難，1 h的累積溶出度不到10%，4 h的累積溶出度僅為20%左右，較低的溶出度成為限制溶出行為的主要因素，無法體現(xiàn)出黏附微丸的緩釋作用。結(jié)合實驗室前期體內(nèi)藥動學研究，比格犬口服復方丹參黏附微丸后，丹參酮ⅡA與隱丹參酮的藥時曲線下面積（AUC）均明顯高于FDP，黏附微丸的生物利用度明顯提高，體內(nèi)滯留時間增長表明黏附微丸具有緩釋作用。

本實驗建立了測定不同工藝制備的復方丹參微丸中隱丹參酮與丹參酮ⅡA含量測定方法以及其體外溶出度的考察方法，并對3種微丸（BI-FDAP、BE-FDAP、FDP）中隱丹參酮與丹參酮ⅡA的體外溶出度進行對比，對黏附微丸的緩釋作用進行評價。結(jié)果表明與FDP相比，復方丹參黏附微丸具有一定的緩釋作用，為制備提高復方丹參生物利用度的新型制劑提供了依據(jù)。此外，由于脂溶性成分溶出度低的特性，在評價其黏附作用時，結(jié)合體內(nèi)及體外數(shù)據(jù)會更加全面。