王海波, 郭俊云, 唐利洲, 劉 潮

(1.曲靖師范學(xué)院, 云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心, 云南省高校云貴高原動(dòng)植物遺傳多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 曲靖 655011; 2.曲靖師范學(xué)院 生物資源與食品工程學(xué)院, 云南 曲靖 655011)

在真核生物中，反式作用因子(Trans-acting factor)能直接或間接識(shí)別、結(jié)合啟動(dòng)子及RNA聚合酶[1]。此類蛋白的不同功能區(qū)通過結(jié)合功能基因或調(diào)控基因的啟動(dòng)子順式作用元件或與其他蛋白互作來調(diào)控基因的表達(dá)[2]。植物體內(nèi)參與逆境脅迫響應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子家族包括AP2/ERF、bZIP、WRKY、NAC、MYB等，而植物體內(nèi)普遍存在且數(shù)量眾多、功能多樣的bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族是抗逆性形成的主要參與者[3]。堿性亮氨酸拉鏈(Basic leucine zipper，bZIP)是廣泛存在于真核生物中的保守轉(zhuǎn)錄因子，多序列比對分析顯示，其核心bZIP結(jié)構(gòu)域由60～80個(gè)氨基酸殘基組成，包括堿性結(jié)構(gòu)域(BR)與亮氨酸拉鏈區(qū)(LZ)[4]。BR位于bZIP蛋白的N端，由約16個(gè)氨基酸殘基組成N-X7-R/K(X代表任意氨基酸殘基)基序[3]，是包括核定位信號(hào)以及可以結(jié)合順式作用元件的堿性區(qū)域，而LZ區(qū)每隔7個(gè)氨基酸殘基存在1個(gè)亮氨酸，通過形成雙極性的α-螺旋結(jié)構(gòu)與BR區(qū)緊密結(jié)合并調(diào)節(jié)bZIP蛋白與DNA結(jié)合之前的二聚體化過程[3,5]。bZIP 類轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別基因啟動(dòng)子的核心序列為ACGT順式作用元件如CACGTG(G盒)、GACGTC(C盒)、TACGTA(A盒)、AACGTT(T盒)以及TGA(G/C)TCA(GCN4)等，一些受光或脫落酸(ABA)誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子區(qū)都含有這些元件，其中G盒元件普遍存在于受 ABA、生長素、茉莉酸、水楊酸誘導(dǎo)的基因中[3,6-7]。根據(jù)bZIP轉(zhuǎn)錄因子DNA的結(jié)合特異性及堿性區(qū)域的氨基酸排列順序，Jakoby等[3]將bZIP基因家族分為A、B、C、D、E、F、G、H、I及S 10個(gè)亞族，其中，A亞族與S亞族研究較為廣泛，而B亞族與F亞族則報(bào)道較少。文獻(xiàn)報(bào)道，A、C、S亞族主要參與植物非生物脅迫響應(yīng)過程及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的調(diào)控，而D、G、H、I亞族在植物防御生物病害、種子成熟、光形態(tài)建成、氮素同化、維管系統(tǒng)發(fā)育等生理生化過程發(fā)揮重要作用[8]。

目前，多種植物的bZIP基因家族已經(jīng)在全基因組水平進(jìn)行了鑒定及分析，其中擬南芥75個(gè)[3]、水稻89個(gè)[4]、玉米125個(gè)[5]、大豆131個(gè)[9]、高粱92個(gè)[10]、葡萄55個(gè)[11]、番茄76個(gè)[12]、蘋果120個(gè)[13]。

小桐子(JatrophacurcasL.)屬大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬(Jatropha)落葉灌木或小喬木，作為新興開發(fā)的木本油料植物，其種子含油量高，品質(zhì)優(yōu)良，成分接近石化柴油，兼具良好的經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效應(yīng)，具有極為廣闊的開發(fā)前景。2011年，小桐子基因組由日本Kazusa DNA研究所首次測序完成[14]，2014年，中國科學(xué)院對小桐子基因組進(jìn)行了高通量重測序，為從基因組水平上分析小桐子bZIP基因家族提供了條件。本研究對小桐子bZIP基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定，并系統(tǒng)分析了其基因成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系、染色體定位、共線性關(guān)系及低溫條件下的表達(dá)特性等，為篩選潛在的與小桐子抗冷相關(guān)bZIP基因并進(jìn)行功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)所用小桐子種子取自云南省楚雄州元謀縣干熱河谷地區(qū)(東經(jīng)101°40′，北緯25°23′)。選取飽滿的小桐子種子，用1.0% CuSO4消毒20 min，無菌水漂洗5次，置燒杯中水浸吸漲24 h。將吸漲的種子在無菌水中漂洗3次，播于墊有飽和無菌水海綿的托盤中，于溫度26 ℃、相對濕度75%的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)5 d。將發(fā)芽的種子播于消毒的培養(yǎng)土中并于溫度26 ℃、相對濕度75%、光周期16 h/8 h的恒溫培養(yǎng)箱中生長15 d至第2片真葉展開，每天用無菌水澆灌培養(yǎng)土。將生長15 d的小桐子幼苗置于溫度12 ℃、相對濕度75%、16 h/8 h光周期的低溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理，分別取低溫處理12，24，48 h與對照(CK，正常培養(yǎng))的第2片真葉與根，以及吸漲24 h的種子，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中用于RNA的提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小桐子bZIP基因家族的鑒定 從GenBank下載小桐子最新注釋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。通過Pfam(http://pfam.xfam.org/)下載bZIP結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫HMM模型(PF00170、PF07716、CPF12498、PF03131)，利用Hmmer 3.0軟件的Hmmsearch程序?qū)π⊥┳拥鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索(閾值E<1e-10，序列相似性>50%)，得到候選的小桐子bZIP蛋白質(zhì)序列，利用Excel腳本去除重復(fù)序列。從TAIR數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)下載75個(gè)已經(jīng)鑒定的擬南芥bZIP基因的蛋白質(zhì)序列[3]，通過ClustalX進(jìn)行多重序列比對，利用Hmmer 3.0軟件的Hmmbuild程序?qū)⒈葘ξ募D(zhuǎn)換為HMM模型，同上條件對小桐子蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。將以上2種方法獲得的小桐子bZIP蛋白質(zhì)序列取并集，經(jīng)過去除重復(fù)序列，將非冗余的候選序列利用Pfam與CDD在線工具分析bZIP蛋白結(jié)構(gòu)域做進(jìn)一步篩選，得到最終的小桐子bZIP家族蛋白質(zhì)序列。

1.2.2 小桐子bZIP家族基因的基本參數(shù)分析 將鑒定到的小桐子bZIP蛋白質(zhì)序列對小桐子基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行tBlastN相似性檢索，下載其對應(yīng)的基因序列、ORF(Open Reading Frame)序列、mRNA序列以及CDS(Coding sequence)序列。利用ExPaSy提供的在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對得到的小桐子bZIP蛋白質(zhì)序列進(jìn)行氨基酸數(shù)目、理論分子量(Mw)、等電點(diǎn)(pI)、氨基酸組成等基本參數(shù)的分析。亞細(xì)胞定位采用CELLO服務(wù)器V2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行鑒定。另外，根據(jù)bZIP的CDS序列對小桐子基因組進(jìn)行BlastN相似性檢索得到各bZIP基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的調(diào)控序列，并通過PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對其順式作用元件進(jìn)行鑒定。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析 將鑒定到的小桐子bZIP蛋白序列利用ClustalX(Version 2.0)進(jìn)行序列相似性比對，然后用MEGA 6.0軟件通過鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并采用自展法(Bootstrap)進(jìn)行檢驗(yàn)。利用軟件GenBank的Spidey工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi)進(jìn)行bZIP的CDS序列與基因序列比對以確定基因內(nèi)含子與外顯子的結(jié)構(gòu)，并利用GSDS(Gene Structure Display Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)圖。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線分析工具對bZIP蛋白質(zhì)序列進(jìn)行motif分析(參數(shù)設(shè)置：最優(yōu)氨基酸殘基寬度6～200；任意數(shù)量的重復(fù)次數(shù)；最多預(yù)測10個(gè)motif)。利用GenDOC軟件對ClustalX比對結(jié)果進(jìn)行bZIP蛋白的bZIP保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.2.4 染色體定位及基因家族復(fù)制與共線性分析 染色體定位以Wu等[15]構(gòu)建的小桐子遺傳連鎖圖譜進(jìn)行錨定，并通過MapChart(Version 2.1)繪制基因定位圖。利用Mauve(Version 2.4)進(jìn)行小桐子bZIP家族基因的復(fù)制共線性分析，其中，片段復(fù)制(Ancient segmental duplication)基因?qū)皩?yīng)的Ka(The number of nonsynonymous substitutions per nonsynonymous site，非同義突變率)、Ks(The number of synonymous substitutions per synonymous site，同義突變率)值通過PAL2NAL在線軟件的CODEMAL程序進(jìn)行鑒定與計(jì)算[16]，并通過Ka/Ks比值以確定基因在進(jìn)化中受到的選擇壓力，分化時(shí)間采用Ks/2λ計(jì)算，其中λ取值為6.1×10-9，同時(shí)，利用Circos(http://www.circos.ca/)(Versioin0.69)繪制bZIP家族基因在小桐子染色體的定位及基因間的共線性關(guān)系。

1.2.5 小桐子bZIP家族基因的表達(dá)分析 從GenBank的SRA數(shù)據(jù)庫下載小桐子不同器官的Illumina高通量測序數(shù)據(jù)(葉片SRR1639660、根SRR1639659、種子SRR1639661)。通過Bowtie2與Samtools工具將鑒定到的小桐子bZIP家族基因與測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，得到各bZIP基因的表達(dá)Reads數(shù)據(jù)，之后通過Cufflinks程序計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)量FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)值，進(jìn)行以2為底的對數(shù)轉(zhuǎn)化，選擇層次聚類法(Hierarchical clustering)對基因與不同器官分別進(jìn)行聚類。另外，以筆者前期小桐子轉(zhuǎn)錄組[17]與數(shù)字基因表達(dá)譜(Digital gene expression)[18]數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，提取對照與12 ℃低溫處理12，24，48 h的bZIP基因的原始Clean Taq數(shù)據(jù)，通過TPM(Transcript per million clean tags)獲得標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)量[19-20]，得到小桐子bZIP家族基因在低溫處理下的差異表達(dá)數(shù)據(jù)。利用R軟件(Version 3.4.1)的Gplots與Pheatmap函數(shù)進(jìn)行聚類分析熱圖(Heatmap)的繪制。

利用TRIzol法(Invitrogen公司)提取小桐子葉片、根、種子及對照與不同低溫處理下葉片與根的總RNA，并利用DNase Ⅰ(Thermo公司)消化RNA中的殘余基因組DNA，得到純化的總RNA。分別取3 μg總RNA，以Random primer為逆轉(zhuǎn)錄引物，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo公司)合成第一鏈cDNA。基于高通量差異表達(dá)數(shù)據(jù)，分別以β-Actin與GADPH為器官表達(dá)與低溫表達(dá)內(nèi)參，進(jìn)行bZIP基因的器官(JcbZIP3、JcbZIP17、JcbZIP22、JcbZIP33、JcbZIP41)與低溫處理(JcbZIP1、JcbZIP3、JcbZIP6、JcbZIP10、JcbZIP14)qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)表達(dá)分析，所用儀器為Bio-Rad CFX Connect，試劑為Power SYBR Green PCR Master Mix(Thermo公司)，所用引物序列見表1，20 μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品重復(fù)3次。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45個(gè)循環(huán)；之后增加溶解曲線程序：65～95 ℃連續(xù)檢測信號(hào)5 s，0.5 ℃增量。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對表達(dá)量分析。器官差異表達(dá)分析以葉片的表達(dá)量為基準(zhǔn)，低溫差異表達(dá)分析以對照(CK)的表達(dá)量為基準(zhǔn)。

表1 qRT-PCR表達(dá)分析引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR expression analysis

AA.氨基酸殘基數(shù)量；Ip.等電點(diǎn)；EN.外顯子數(shù)量。The AA, Ip, and EN represent amino acid residue count, isoelectric point, and exon count, respectively.

2 結(jié)果與分析

2.1 小桐子bZIP基因家族的鑒定與序列特征

通過bZIP結(jié)構(gòu)域的HMM模型檢索，在小桐子全基因組共鑒定到51個(gè)bZIP基因家族成員，分別命名為JcbZIP1-JcbZIP51(表2、圖1)。理化參數(shù)分析結(jié)果表明，小桐子51個(gè)bZIP基因的基因長度分布在647(JcbZIP23)～16 972(JcbZIP6)bp，蛋白質(zhì)長度分布在113(JcbZIP13)～768(JcbZIP43)個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)分布在4.70(JcbZIP14)～10.30(JcbZIP15)。根據(jù)CELLO的預(yù)測顯示，除JcbZIP34定位在葉綠體之外，其他50個(gè)小桐子bZIP基因都定位在細(xì)胞核(表2)。

表2 小桐子bZIP基因家族基因參數(shù)Tab.2 Gene parameters of bZIP genes in J.curcas

2.2 小桐子bZIP基因家族的基因結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)Jakoby等[3]擬南芥bZIP基因家族的分類標(biāo)準(zhǔn)，通過ClustalX構(gòu)建小桐子bZIP基因家族進(jìn)化樹，依據(jù)聚類特點(diǎn)及bZIP結(jié)構(gòu)域的氨基酸特性，分為A(13個(gè))、B(3個(gè))、C(3個(gè))、D(7個(gè))、E(4個(gè))、F(1個(gè))、G(3個(gè))、H(2個(gè))、I(7個(gè))及S (8個(gè))10個(gè)亞族(圖1)。結(jié)果顯示，聚類亞族與bZIP基因結(jié)構(gòu)、氨基酸長度、等電點(diǎn)及外顯子數(shù)量呈直接相關(guān)性。其中，D、E、G、H及S亞族的氨基酸長度分布較為集中，S亞族蛋白長度主要分布在100～200個(gè)氨基酸，E亞族蛋白分布在300～400個(gè)氨基酸，而C與G亞族蛋白分布在300～450個(gè)氨基酸。另外，C與D亞族成員的等電點(diǎn)多集中在6～7，而A與H亞族成員的等電點(diǎn)多偏堿性，大部分分布在7～10。同時(shí)，各亞族成員都存在顯著的基因結(jié)構(gòu)特異性，S亞族除JcbZIP7之外，7個(gè)基因都只有1個(gè)外顯子，且基因長度較短，都存在5′-UTR與3′-UTR區(qū)域；E、H及I亞族基因存在4～5個(gè)外顯子，且大部分基因的第一與最后一個(gè)外顯子分別與5′-UTR和3′-UTR區(qū)域重合，而中間的2～3個(gè)外顯子則較短且較為分散；A亞族基因存在3～6個(gè)外顯子，且部分基因如JcbZIP4、JcbZIP11、JcbZIP31及JcbZIP44存在獨(dú)立外顯子的5′-UTR區(qū)域，而D(JcbZIP9、JcbZIP19、JcbZIP22及JcbZIP25)與G(JcbZIP29、JcbZIP35及JcbZIP40)亞族部分基因也存在類似現(xiàn)象；G亞族3個(gè)基因包含12～13個(gè)外顯子，是小桐子bZIP基因家族中外顯子最多的，且分布規(guī)律與D亞族基因類似(圖1)。

通過MEME對小桐子51個(gè)bZIP基因的蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域檢索，都鑒定到1個(gè)長度為60～80個(gè)氨基酸的保守bZIP結(jié)構(gòu)域(圖2)。其中， D與S亞族成員bZIP結(jié)構(gòu)域主要分布在N端，亞族A、E、G及H主要分布在C端，而亞族B、C、F及I則主要集中在氨基酸序列的中部。進(jìn)一步通過ClustalX對小桐子51個(gè)bZIP基因的bZIP結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對，表明小桐子bZIP結(jié)構(gòu)域N端都含有一個(gè)堿性區(qū)域N-X7-R/K，接著R/K 9個(gè)氨基酸之后，每隔7個(gè)氨基酸存在一個(gè)Leu，即亮氨酸拉鏈區(qū)域。其中，堿性區(qū)域R/K氨基酸殘基(圖3星號(hào)所示)之后的-RK-(圖3箭頭所示)絕對保守，所有小桐子bZIP成員都相同，亮氨酸拉鏈區(qū)的第2個(gè)Leu也較為保守，而第3個(gè)Leu則在不同的bZIP成員中差異較大(圖3)。

1號(hào)表示bZIP結(jié)構(gòu)域。bZIP domains are indicated by No.1.

2.3 小桐子bZIP家族基因順式作用元件鑒定

通過PlantCARE工具對小桐子51個(gè)bZIP基因起始密碼子ATG上游1 500 bp啟動(dòng)子序列的13個(gè)順式作用元件進(jìn)行鑒定(表3)，結(jié)果表明，JcbZIP3基因鑒定到最多27個(gè)元件，而JcbZIP8僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)元件。其中，響應(yīng)激素的元件中，包含赤霉素元件(GARE-motif)、脫落酸元件(ABRE)、乙烯元件(ERE)、生長素元件(Aux-core)的bZIP基因分別鑒定到31，26，19，4個(gè)，其中JcbZIP2與JcbZIP4最多鑒定到4個(gè)赤霉素響應(yīng)元件、JcbZIP3最多鑒定到13個(gè)脫落酸響應(yīng)元件。另外，分別有25，33個(gè)小桐子bZIP基因鑒定到響應(yīng)茉莉酸甲酯(CGTCA-motif/TGACG-motif)與水楊酸(TCA-element)信號(hào)分子元件。同時(shí)有35個(gè)bZIP基因還發(fā)現(xiàn)了防御與脅迫響應(yīng)相關(guān)元件(TC-rich repeats)，占小桐子bZIP基因總數(shù)的68.7%，預(yù)示大部分bZIP基因參與小桐子逆境脅迫應(yīng)答過程，其中，41個(gè)(80.4%)bZIP基因包含高溫響應(yīng)元件(HSE)、21個(gè)包含創(chuàng)傷響應(yīng)元件(W-box、WUN-motif)、14個(gè)包含低溫響應(yīng)元件(LTR)。

實(shí)線表示堿性結(jié)構(gòu)域(BR)，虛線表示亮氨酸拉鏈區(qū)(LZ)；星號(hào)表示N-X7-R/K基序的保守Arg(R)或Lys(K)殘基；三角形表示保守的Leu殘基；箭頭表示保守的-RK-殘基。Basic region (BR) and Leucine zipper (LZ) are showed by solid and dotted lines, respectively; the asterisk represents the conserved Arg or Lys residues in N-X7-R/K motif; the triangles indicate the three conserved Leu residues in leucine zipper region; and the arrows mean the conserved-RK-residues.

基因名稱Gene namesABREAREAux-coreCGTCA-motif/TGACG-motifEREGARE-motifHSELTRMBSTC-rich repeatsTCA-elementW-boxWUN-motif總數(shù)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

注：ABRE (TACGTG).脫落酸響應(yīng)元件；ARE (TGGTTT/AAACCA).厭氧響應(yīng)元件； Aux-core (GGTCCAT).生長素響應(yīng)元件；CGTCA-motif/TGACG-motif (CGTCA/TGACG).茉莉酸甲酯響應(yīng)元件； ERE (ATTTCAAA).乙烯響應(yīng)元件；GARE-motif (AAACAGA/TCTGTTG).赤霉素響應(yīng)元件； HSE (GAAAATTCG/AAAAAATTTC/AAAAAATTTC/AAAAAATTTC).高溫響應(yīng)元件； LTR (CCGAAA).低溫響應(yīng)元件； MBS (CGGTCA).MYB結(jié)合元件；TC-rich repeats (ATTCTCTAAC/ATTTTCTTCA/GTTTTCTTAC/ATTTTCTCCA).防御響應(yīng)元件；TCA-element (CAGAAAAGGA/TCAGAAGAGG/GAGAAGAATA/CCATCTTTTT).水楊酸響應(yīng)元件；W-box (TTGACC).創(chuàng)傷與病原菌響應(yīng)元件； WUN-motif (TCATTACGAA/AAATTTCCT).創(chuàng)傷響應(yīng)元件。

Note：ABRE (TACGTG).Cis-acting element involved in abscisic acid responsiveness; ARE (TGGTTT/AAACCA). Cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction; Aux-core (GGTCCAT). Cis-acting regulatory element involved in auxin responsiveness; CGTCA-motif/TGACG-motif (CGTCA/TGACG). Cis-acting regulatory element involved in MeJA responsiveness; ERE (ATTTCAAA). Ethylene-responsive element; GARE-motif (AAACAGA/TCTGTTG). Gibberellin-responsive element; HSE (GAAAATTCG/AAAAAATTTC/AAAAAATTTC/AAAAAATTTC). Cis-acting element involved in heat stress responsiveness; LTR (CCGAAA). Cis-acting element involved in low-temperature responsiveness; MBS (CGGTCA). MYB binding site; TC-rich repeats (ATTCTCTAAC/ATTTTCTTCA/GTTTTCTTAC/ATTTTCTCCA). Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness; TCA-element (CAGAAAAGGA/TCAGAAGAGG/GAGAAGAATA/CCATCTTTTT). Cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness; W-box (TTGACC). Cis-acting regulatory element involved in wounding and pathogen responsiveness; WUN-motif (TCATTACGAA/AAATTTCCT). Wound-responsive element.

2.4 小桐子bZIP基因家族染色體定位及復(fù)制分析

依據(jù)Wu等[15]構(gòu)建的小桐子高密度遺傳連鎖圖譜，通過基因組Scaffold數(shù)據(jù)在染色體水平定位每個(gè)小桐子bZIP基因，并使用MapChart使信息可視化(圖4)，結(jié)果表明，51個(gè)小桐子bZIP基因不均勻地分布于11條染色體上，其中4號(hào)染色體上的基因數(shù)量最多13個(gè)，占小桐子bZIP基因總數(shù)的25.5%，11號(hào)染色體的基因數(shù)最少，僅有1個(gè)。基因組及基因片段復(fù)制與基因串聯(lián)復(fù)制是基因家族擴(kuò)張與蛋白質(zhì)功能多樣性演化的重要方式。在小桐子2號(hào)與4號(hào)染色體鑒定到bZIP基因家族的5對串聯(lián)復(fù)制，如JcbZIP22/JcbZIP31、JcbZIP24/JcbZIP32、JcbZIP25/JcbZIP26、JcbZIP14/JcbZIP20、JcbZIP16/JcbZIP21，另外，小桐子bZIP基因家族在進(jìn)化中存在11對片段復(fù)制現(xiàn)象(圖4虛線所示)，進(jìn)一步對其進(jìn)行進(jìn)化選擇壓力分析表明(表4)，所有片段復(fù)制基因?qū)Φ腒a/Ks<1，表明這些基因都受純化選擇(Purifying selection)，進(jìn)化分歧時(shí)間在108.442 6百萬～445.024 6百萬年。以上結(jié)果暗示，小桐子bZIP基因家族在擴(kuò)張進(jìn)化與功能分化過程中片段復(fù)制起更主要的作用，與擬南芥[3]、葡萄[11]、番茄[12]中的研究結(jié)果一致。同時(shí)，共線性分析顯示，大量bZIP基因?qū)Υ嬖诮徊婀簿€性關(guān)系，表明小桐子bZIP基因在進(jìn)化過程中，含有這些bZIP基因的Scaffold或染色體片段發(fā)生了基因組倍增(Paleopolyploidy)(圖5)。

灰色區(qū)域表示基因組片段復(fù)制，虛線表示基因片段復(fù)制，豎線表示基因串聯(lián)復(fù)制；刻度表示厘摩；LG表示染色體。The gray areas represent genome-wide segmental duplication, the dotted lines indicate ancient segmental duplication, and the vertical black lines indicate tandem duplication based on genome synteny; The scale is in centiMorgans (cM); LG.Chromosome.

圖5 小桐子bZIP家族基因的共線性分析Fig.5 Synteny analysis of J.curcas bZIP genes

復(fù)制基因Duplicate genes一致性/%IdentityKaKsKa/Ks分化時(shí)間/百萬年Divergence time純化選擇Purifying selectionJcbZIP7/JcbZIP1277.010.167 32.812 40.059 5230.524 6+JcbZIP33/JcbZIP4777.590.206 52.621 00.078 8214.836 1+JcbZIP9/JcbZIP3881.030.149 31.323 00.112 9108.442 6+JcbZIP19/JcbZIP2575.860.202 11.358 60.148 7111.360 7+JcbZIP49/JcbZIP5176.440.564 02.117 90.266 3173.598 4+JcbZIP24/JcbZIP5082.760.299 12.374 20.126 0194.606 6+JcbZIP16/JcbZIP4279.880.254 51.982 70.128 4162.516 4+JcbZIP17/JcbZIP2878.160.322 24.430 30.072 7363.139 3+JcbZIP21/JcbZIP4172.990.607 15.429 30.111 8445.024 6+JcbZIP4/JcbZIP3173.560.447 64.314 30.103 8353.631 1+JcbZIP5/JcbZIP1178.160.261 61.842 40.142 0151.016 4+

注：一致性表示兩基因相互匹配部分的相似性；Ka、Ks分別表示非同義突變率與同義突變率；分化時(shí)間用Ks/2λ計(jì)算，其中λ取值為6.1×10-9。

Note： Identity indicates the identity of alignment part in two genes; Ka and Ks indicate the number of nonsynonymous substitutions per nonsynonymous site and the number of synonymous substitutions per synonymous site, respectively; Divergence time was calculated by Ks/2λ (λ=6.1×10-9).

2.5 小桐子bZIP家族基因的表達(dá)分析

從GenBank的SRA數(shù)據(jù)庫下載小桐子葉片、根及種子的高通量表達(dá)測序數(shù)據(jù)，以FPKM為參數(shù)，通過Cufflinks程序得到小桐子51個(gè)bZIP基因的表達(dá)量，利用R軟件對表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析及熱圖繪制(圖6-A)。結(jié)果表明，有26個(gè)bZIP基因在小桐子3種器官中都有表達(dá)，其中，JcbZIP7、JcbZIP12、JcbZIP14、JcbZIP39及JcbZIP43的表達(dá)量較高，而JcbZIP13、JcbZIP15、JcbZIP23、JcbZIP26、JcbZIP27及JcbZIP48在3種器官中都沒有表達(dá)。在葉片、根及種子中分別鑒定到有30，42，40個(gè)bZIP基因表達(dá)，另外，有25個(gè)小桐子bZIP基因的表達(dá)存在器官特異性，如JcbZIP17、JcbZIP33及JcbZIP46僅在根中有表達(dá)；JcbZIP31、JcbZIP32及JcbZIP45僅在種子有表達(dá)；JcbZIP4、JcbZIP8、JcbZIP22、JcbZIP24、JcbZIP28、JcbZIP30、JcbZIP37及JcbZIP50在根與種子中表達(dá)量較高，而在葉片中表達(dá)量較低或不表達(dá)；JcbZIP41在葉片與根中表達(dá)，而在種子中不表達(dá)。通過qRT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證JcbZIP17與JcbZIP33在根中表達(dá)量較高，而JcbZIP41在葉片中表達(dá)量較高(圖7)，與測序數(shù)據(jù)的結(jié)果一致。

A.器官差異表達(dá); B.低溫處理差異表達(dá)。A.Differential expression in different organs; B.Differential expression under chilling hardening.

通過數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析得到27個(gè)小桐子bZIP家族基因低溫處理下在葉片中的表達(dá)數(shù)據(jù)(圖6-B)，其中，鑒定到14個(gè)bZIP基因在低溫條件下上調(diào)表達(dá)。與對照相比，JcbZIP1、JcbZIP3、JcbZIP7、JcbZIP13、JcbZIP14、JcbZIP39、JcbZIP44及JcbZIP47在低溫條件下上調(diào)表達(dá)顯著，而JcbZIP3與JcbZIP14達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)，qRT-PCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示兩者表達(dá)量在低溫鍛煉24 h時(shí)達(dá)到最高(圖8)，與小桐子抗冷性的形成及低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程直接相關(guān)，也作為抗冷功能基因篩選的候選目標(biāo)。同時(shí)，JcbZIP6、JcbZIP26、JcbZIP27、JcbZIP34及JcbZIP43在低溫鍛煉的不同時(shí)間段都有小量上調(diào)表達(dá)，但都未達(dá)到顯著水平，其中，JcbZIP6基因的qRT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證與測序數(shù)據(jù)吻合(圖8)。相反，JcbZIP4、JcbZIP24、JcbZIP28、JcbZIP32及JcbZIP36下調(diào)表達(dá)明顯，其中，JcbZIP36在低溫處理12，24 h時(shí)較對照都下調(diào)表達(dá)104.0倍(P<0.01)。另外，對5個(gè)bZIP基因在根中的低溫表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明，低溫處理下，JcbZIP1、JcbZIP3、JcbZIP6及JcbZIP10在低溫處理12 h時(shí)表達(dá)量都有一定上調(diào)，但都未達(dá)到顯著水平，說明在根中其對低溫處理不敏感，而JcbZIP14基因隨著低溫處理時(shí)間的延長，表達(dá)量持續(xù)上調(diào)，可能參與小桐子根中低溫脅迫的響應(yīng)過程(圖9)。

圖7 小桐子不同器官中bZIP基因的qRT-PCR差異表達(dá)分析Fig.7 Differential expression analysis of bZIP genes in different organs

A.JcbZIP1; B.JcbZIP3; C.JcbZIP6; D.JcbZIP10; E.JcbZIP14。圖9同。A.JcbZIP1; B.JcbZIP3; C.JcbZIP6; D.JcbZIP10; E.JcbZIP14.The same as Fig.9.

圖9 低溫處理下小桐子bZIP基因在根中的qRT-PCR表達(dá)分析Fig.9 qRT-PCR relative expression levels of J.curcas bZIP genes in roots under chilling hardening

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道，A、B、H及S亞族bZIP基因主要參與植物非生物脅迫響應(yīng)及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。其中，A亞族bZIP基因的信號(hào)傳遞主要依賴于ABA信號(hào)途徑，如擬南芥A亞族的AREB(ABA response element)/ABFs(ABA-responsive element binding proteins)類bZIP轉(zhuǎn)錄因子，可激活非生物逆境脅迫下的ABA依賴基因的表達(dá)[21]。其中，ABF1主要參與低溫、ABA脅迫應(yīng)答，ABF2與ABF4主要參與干旱、高鹽、高溫及氧化脅迫應(yīng)答，而ABF3則受到ABA、低溫脅迫的誘導(dǎo)[8,21-22]。在小桐子A亞族中鑒定到8個(gè)AREB/ABFs類bZIP轉(zhuǎn)錄因子，JcbZIP4、JcbZIP5、JcbZIP18、JcbZIP26、JcbZIP31、JcbZIP34、JcbZIP44及JcbZIP48，且在其bZIP結(jié)構(gòu)域的堿性區(qū)域都發(fā)現(xiàn)M/KIK與QAY/Q特有基序[8]，以上bZIP轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合非生物脅迫響應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的ABA響應(yīng)元件ABRE(ABA response element)從而激活基因的表達(dá)，參與小桐子一系列抗逆性響應(yīng)過程。另外，本研究中鑒定的51個(gè)小桐子bZIP基因，有26個(gè)基因在其啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了ABRE元件，其中JcbZIP3最多有13個(gè)ABRE元件，說明部分小桐子bZIP基因的表達(dá)也受到ABA信號(hào)分子的調(diào)控，與擬南芥報(bào)道的ABI5轉(zhuǎn)錄因子一致[23]，綜合分析發(fā)現(xiàn)，小桐子bZIP基因的JcbZIP18與JcbZIP48同時(shí)兼具ABRE元件受到ABA的表達(dá)調(diào)控，同時(shí)也可以結(jié)合其他基因的ABRE元件調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。根據(jù)擬南芥bZIP基因的功能驗(yàn)證報(bào)道，B亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子如擬南芥AtbZIP17(At2g40950)[24]、AtbZIP28(At3g10800)[25-26]可以作為非生物逆境脅迫的感應(yīng)器和傳感器，通過C端錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，促進(jìn)脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，尤其在抗鹽脅迫中發(fā)揮作用[26]，而小桐子中與AtbZIP17及AtbZIP28的同源基因JcbZIP43在其啟動(dòng)子中鑒定到防御相關(guān)元件、高溫及低溫響應(yīng)元件，同時(shí)氨基酸序列的C端二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測以α-螺旋為主，且富含非極性氨基酸殘基如Leu、Val，預(yù)示JcbZIP43可能通過C端α-螺旋定位在膜結(jié)構(gòu)上，發(fā)揮調(diào)節(jié)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。另外，擬南芥H亞族的HY5(AtbZIP56、At5g11260)與HYH(AtbZIP64、At3g17609)主要在光形態(tài)建成中發(fā)揮作用[27]，都含有CKII磷酸化位點(diǎn)與WD40作用結(jié)構(gòu)域[3,28-29]，另外還可以結(jié)合生長素(AUX/IAAs)、乙烯(ERFs)及赤霉素途徑的靶基因從而響應(yīng)激素應(yīng)答信號(hào)[30]。小桐子H亞族也包含2個(gè)基因，順式作用元件分析表明，分別在小桐子HY5同源基因JcbZIP21與HYH同源基因JcbZIP21的啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)赤霉素(GARE)與乙烯(ERE)響應(yīng)元件，說明小桐子H亞族2個(gè)基因同樣也參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。S亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子一般成員較多，大部分基因廣泛受脅迫處理的激活，如低溫等[4-5,31]。進(jìn)一步分析表明，小桐子51個(gè)bZIP基因中有14個(gè)在其啟動(dòng)子中鑒定到低溫響應(yīng)元件(LTR)，其中，小桐子S亞族bZIP基因中，JcbZIP7、JcbZIP30、JcbZIP33及JcbZIP39包含LTR元件，可能參與小桐子抗冷性形成過程，其余10個(gè)小桐子低溫響應(yīng)bZIP基因分別屬于A(JcbZIP4、JcbZIP5、JcbZIP23)、B(JcbZIP3、JcbZIP43)、C(JcbZIP20)、D(JcbZIP46)、H(JcbZIP21)及I(JcbZIP24、JcbZIP50)亞族，同時(shí)，數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)也顯示，JcbZIP3、JcbZIP7、JcbZIP20、JcbZIP39及JcbZIP43在低溫處理下上調(diào)表達(dá)，與預(yù)測結(jié)果一致。

同源或異源的2個(gè)bZIP結(jié)構(gòu)域形成二聚體，通過堿性區(qū)域(Basic region)特異結(jié)合下游基因啟動(dòng)子序列從而調(diào)控其表達(dá)，其核心元件序列為ACGT[32]。部分植物病原相關(guān)基因啟動(dòng)子上也存在G-box(CACGTG)或C-box(GACGTC)序列(下劃線表示核心元件序列ACGT)，功能研究表明，當(dāng)植物遇到病原浸染時(shí)，擬南芥D亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子如TGA1(At5g65210)[33]、TGA2/AHBP-1b(At5g06950)[34]、TGA3(At1g22070)[35]、TGA4/OBF4(At5g10030)[36]、TGA5/OBF5(At5g06960)[34]、TGA6(At3g12250)[34]可以結(jié)合以上元件，從而誘導(dǎo)病原相關(guān)基因(PR)的通體表達(dá)，使植物獲得系統(tǒng)抗病性(SAR)，其中，除bZIP結(jié)構(gòu)域外的DOG1基序?qū)τ贒亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子功能的發(fā)揮也是必需的。本研究中7個(gè)小桐子D亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子的bZIP結(jié)構(gòu)域之后也都鑒定到DOG1基序，包括保守的序列-D/ELRI/L-與-GGFRS/PSELLK/NLL-，另外，小桐子G亞族3個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子JcbZIP29、JcbZIP35、JcbZIP40的bZIP結(jié)構(gòu)域之前都發(fā)現(xiàn)了MFMR結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域長度150～200個(gè)氨基酸，其N端主要促進(jìn)bZIP轉(zhuǎn)錄因子與G-box的結(jié)合從而調(diào)控光信號(hào)感應(yīng)與傳遞相關(guān)基因的表達(dá)，而C端包含富Pro區(qū)域(Proline rich domain，PRD)與核定位信號(hào)序列，并且3個(gè)小桐子G亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子都鑒定到該結(jié)構(gòu)域保守序列-P[HP]YMW-、-MMPP/SYGT/AP-及-YAHP-，與擬南芥G亞族同源轉(zhuǎn)錄因子GBF1(At4g36730)[37]、GBF2(At4g01120)[38]及GBF3(At2g46270)[39]的蛋白結(jié)構(gòu)與功能驗(yàn)證相符。