郭呈宇，柳 俊，李園磊，安 睿，李星巖，哈斯阿古拉

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 作物育種與栽培研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

乙烯作為一種重要植物激素參與多個(gè)植物生長發(fā)育過程和應(yīng)答脅迫反應(yīng)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，乙烯合成存在2種系統(tǒng)，系統(tǒng)Ⅰ和系統(tǒng)Ⅱ[3]。系統(tǒng)Ⅰ完成基礎(chǔ)乙烯合成，主要存在于未成熟果實(shí)和營養(yǎng)生長的器官中，通過自身抑制的方式進(jìn)行調(diào)控；而系統(tǒng)Ⅱ參與果實(shí)成熟和花衰老時(shí)乙烯的大量合成，通過自身催化的方式調(diào)控[4-6]。在番茄中，系統(tǒng)Ⅰ和系統(tǒng)Ⅱ由不同的ACO、ACS家族成員參與[4,7-8]。

乙烯合成關(guān)鍵酶ACO和ACS基因受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。Lin等[9]發(fā)現(xiàn)1個(gè)亮氨酸拉鏈蛋白的同源蛋白LeHB1結(jié)合在番茄LeACO1基因啟動(dòng)子9 bp 的AATA(A)TATT或10 bp 的AATA(AA)TATT特定序列上，對該基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。通過病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，當(dāng)LeHB1基因下調(diào)后，LeACO1基因的表達(dá)受到了抑制，果實(shí)的成熟也被延遲。Ito等[10]通過染色質(zhì)免疫沉淀PCR檢測發(fā)現(xiàn)，番茄的1個(gè)MADS-box蛋白LeMADS-RIN(RIN)會特異性地結(jié)合到LeACS2啟動(dòng)子的CArG box區(qū)域。rin隱性突變的番茄果實(shí)成熟發(fā)育出現(xiàn)障礙，致使該植株既無法大量產(chǎn)生內(nèi)源性乙烯，又無法對外源乙烯做出應(yīng)答，導(dǎo)致果實(shí)無法成熟[11]。RIN被認(rèn)為是乙烯生物合成與調(diào)控中重要的上游調(diào)節(jié)蛋白。

乙烯進(jìn)入細(xì)胞后，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)植物各種生理活動(dòng)。乙烯受體位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，它首先感受乙烯信號，目前已經(jīng)鑒定的擬南芥乙烯受體共5個(gè)，即ETR1、 ETR2、 ERS1、ERS2、EIN4[12]。乙烯受體的下游組分CTR1也位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，與乙烯受體相互作用[13]。CTR1的C末端具有Ser/Thr激酶活性，而N末端可以與自磷酸化的乙烯受體如ETR1的組氨酸激酶域形成復(fù)合物，從而起到負(fù)調(diào)控乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[14]。

本研究在甜瓜全基因組范圍內(nèi)鑒定了乙烯生物合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的4個(gè)基因家族HB(Homeo box)、RIN(Ripening inhibitor)、ETR(Ethylene receptor)和CTR(Constitutive triple reaction)，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。以甜瓜品種河套蜜瓜原種和內(nèi)蒙古大學(xué)牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育的轉(zhuǎn)反義CmACO1基因的河套蜜瓜M9品系[15]為試驗(yàn)材料，分析了上述基因在果實(shí)生長期和成熟期的表達(dá)特性，旨在為發(fā)掘與甜瓜果實(shí)成熟相關(guān)的基因。

1 材料和方法

1.1 植物材料

甜瓜品種河套蜜瓜原種由內(nèi)蒙古大學(xué)牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，轉(zhuǎn)反義CmACO1基因的河套蜜瓜M9品系(以下簡稱M9)由內(nèi)蒙古大學(xué)牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育[14]。將2種材料播種于日光溫室，按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，盛花期人工自交授粉。采摘授粉后10 d(以下簡稱生長期)和30 d果實(shí)(以下簡稱成熟期)(圖1)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)材料采摘3顆果實(shí)，取中果皮組織，速凍于液氮，用于總RNA提取，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。

1.2 四個(gè)基因家族的全基因組鑒定

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已確認(rèn)功能的基因序列，找到番茄LeETR1、LeMADS-RIN1、LeHB1基因和擬南芥AtCTR1基因作為探針基因，并查找各自對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列(表1)，下載FASTA格式的序列文件。然后將該FASTA文件輸入InterPro數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，將探針基因中所有功能域所在區(qū)域的序列作為探針序列。再將探針序列分別輸入甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(MELONOMICS)的Blast工具中，獲得具有與目標(biāo)功能域序列高度相似(E<10-10)序列的蛋白質(zhì)登錄號并下載其FASTA格式文件。最后將甜瓜數(shù)據(jù)庫中篩選到的序列輸入InterPro數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證，剔除功能域不完整的序列，獲得相應(yīng)的基因家族成員。

A．M9生長期果實(shí)；B.河套蜜瓜原種生長期果實(shí)；C.M9成熟期果實(shí)；D.河套蜜瓜原種成熟期果實(shí)。A.M9 fruit at the growth stage; B.Hetao melon fruit at the growth stage; C.M9 fruit at the ripening stage; D.Hetao melon fruit at the ripening stage.

基因名稱Gene name登錄號Accession number序列描述Sequence description長度/bpLengthLeHB1350537501同源域亮氨酸拉鏈蛋白188LeMADS-RIN1350534764MADS盒轉(zhuǎn)錄因子異構(gòu)體1149LeETR1350534616乙烯受體386AtCTR130680171CTR1絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶549

1.3 基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

將鑒定獲得的蛋白序列使用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行比對，獲得保守序列。使用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線軟件預(yù)測各基因家族蛋白序列的保守基序。

1.4 總RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

使用康為世紀(jì)公司TRIzol總RNA提取試劑盒，按照說明書提取總RNA。對總RNA進(jìn)行電泳檢測和純度檢測后交由北京諾禾致源科技股份有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測序。

1.5 基因的表達(dá)量分析

從轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中提取4個(gè)基因家族成員的表達(dá)量FPKM值(Fragments per kilobase of transcript per milion fragment mapped)，使用R 語言工具的 Pheatmap 拓展包繪制聚類熱圖(Heatmap)。篩選高表達(dá)基因，使用SPSS 22.0版本進(jìn)行方差分析，獲得基因差異表達(dá)顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 四個(gè)基因家族的全基因組鑒定

對4個(gè)基因在甜瓜中進(jìn)行全基因組鑒定發(fā)現(xiàn)，CmETR家族有3個(gè)成員、CmCTR家族有20個(gè)成員，CmHB家族有17個(gè)成員，CmRIN家族有21個(gè)成員(表2)。

2.2 四個(gè)基因家族編碼蛋白氨基酸序列分析

對4個(gè)家族成員的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)不同家族的氨基酸序列均存在較多的保守位點(diǎn)，序列相似性較高，說明基因家族鑒定結(jié)果是可靠的。CmETR家族的3個(gè)成員序列相似度較高，保守序列位點(diǎn)分布的位置較廣(圖2-A)，這暗示該家族可能存在多個(gè)保守基序。進(jìn)一步對該家族保守基序分析發(fā)現(xiàn)，基序1，2，3，4的保守性較高(圖3-A)，這與序列比對結(jié)果具有一致性。蛋白質(zhì)的低級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)，高級結(jié)構(gòu)決定其功能。該家族成員具有較高的位點(diǎn)保守性，暗示其在甜瓜中的功能也可能非常相近。CmCTR家族保守序列集中在2個(gè)位置(圖2-B)，對其保守基序分析發(fā)現(xiàn)，基序1，2的保守性最高(圖3-B)，這2個(gè)保守基序可能是該家族基因共有的功能位點(diǎn)。CmHB和CmRIN兩家族的保守序列相對集中(圖2-C-D)，分別對2個(gè)家族的保守基序分析發(fā)現(xiàn)，CmHB的基序5(圖3-C)和CmRIN的基序6(圖3-D)都是非常保守，是這2個(gè)家族成員的典型特征序列。

表2 四個(gè)基因家族成員鑒定結(jié)果Tab.2 The identification of four gene families

A.CmETR家族氨基酸序列比對結(jié)果；B.CmCTR家族氨基酸序列比對結(jié)果；C.CmHB家族氨基酸序列比對結(jié)果；D.CmRIN家族氨基酸序列比對結(jié)果。A.Sequence alignment of CmETR family; B.Sequence alignment of CmCTR family; C.Sequence alignment of CmHB family; D.Sequence alignment of CmRIN family.

A.CmETR家族氨基酸序列比對分析結(jié)果；B.CmCTR家族氨基酸序列比對分析結(jié)果；C.CmHB家族氨基酸序列比對分析結(jié)果；D.CmRIN家族氨基酸序列比對分析結(jié)果。A.Motifs analysis of CmETR family; B.Motifs analysis of CmCTR family; C.Motifs analysis of CmHB family; D.Motifs analysis of CmRIN family.

2.3 四個(gè)基因家族在不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)分析

對4個(gè)基因家族的表達(dá)量聚類結(jié)果(圖4)分析發(fā)現(xiàn)，CmETR、CmCTR和CmHB 3個(gè)家族成員在2個(gè)材料(M9和河套蜜瓜原種)中的表達(dá)量聚為兩類，即生長期的表達(dá)量聚為一類，成熟期的表達(dá)量聚為一類；而CmRIN家族的表達(dá)量分為3類，2個(gè)材料成熟期的表達(dá)量聚為一類，生長期的河套蜜瓜原種和生長期的M9的表達(dá)量各為一類。

CmETR家族3個(gè)成員中CmETR1基因在2個(gè)材料中的2個(gè)時(shí)期均有較高水平的表達(dá)，CmETR2和CmETR3則均表現(xiàn)出基因下調(diào)趨勢。

A.CmETR家族成員表達(dá)量熱圖；B.CmCTR家族成員表達(dá)量熱圖；C.CmHB家族成員表達(dá)量熱圖；D.CmRIN家族成員表達(dá)量熱圖；DF_M_group_fpkm.M9生長期果實(shí)；DF_C_group_fpkm.河套蜜瓜原種生長期果實(shí)；RF_M_group_fpkm.M9成熟期果實(shí)；RF_C_group_fpkm.河套蜜瓜原種成熟期果實(shí)。

A.Heatmap of CmETR family expression; B.Heatmap of CmCTR family expression; C.Heatmap of CmHB family expression; D.Heatmap of CmRIN family expression; DF_M_group_fpkm.M9 fruit at the growth stage; DF_C_group_fpkm.Hetao melon fruit at the growth stage; RF_M_group_fpkm.M9 fruit at ripening stage; RF_C_group_fpkm.Hetao melon fruit at ripening stage.

圖4 四個(gè)基因家族在不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中表達(dá)量的熱圖
Fig.4 Heatmap of the four gene families expression in different fruits

CmCTR的20個(gè)成員中CmCTR1、CmCTR12在原種和M9的生長期果實(shí)中的表達(dá)水平均略高于成熟期，CmCTR15則具有相反表達(dá)模式。CmCTR8和CmCTR20在2個(gè)材料的果實(shí)中均有表達(dá)，在生長期和成熟期的表達(dá)量沒有明顯變化。CmCTR2在M9的成熟期果實(shí)中的表達(dá)水平略高于河套蜜瓜原種。CmCTR17和CmCTR5在河套蜜瓜原種中下調(diào)，而在M9材料中表達(dá)上調(diào)，但需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。CmCTR7在河套蜜瓜原種與M9中2個(gè)時(shí)期的表達(dá)趨勢變化相同，均呈現(xiàn)上調(diào)。

CmHB家族17個(gè)成員中CmHB4和CmHB9的表達(dá)在2個(gè)材料中均表現(xiàn)出上調(diào)，其中CmHB4在生長期幾乎不表達(dá)，在成熟期果實(shí)中則大量表達(dá)。CmHB12和CmHB15則與CmHB4表達(dá)模式相反，其在2個(gè)材料中均表現(xiàn)下調(diào)。CmHB3在2個(gè)材料的成熟期果實(shí)中均有微量表達(dá)。CmHB5在2個(gè)材料的生長期果實(shí)中均有較高水平的表達(dá)。CmHB11在2個(gè)材料中均明顯表現(xiàn)下調(diào)模式。CmHB13在河套蜜瓜原種的2個(gè)時(shí)期表達(dá)水平均很低。

CmRIN家族的21成員中CmRIN2在2個(gè)材料的表達(dá)量表現(xiàn)出一致的下調(diào)模式，但其表達(dá)水平較低。CmRIN3在不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)水平整體較高且表現(xiàn)出上調(diào)。CmRIN14和CmRIN15在2個(gè)材料成熟期果實(shí)中的表達(dá)水平相近，但在不同材料中的表達(dá)模式相反。CmRIN18的表達(dá)水平整體較低。

2.4 四個(gè)家族基因表達(dá)差異分析

篩選FPKM值大于1的所有基因，對其不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)量進(jìn)行方差分析，由圖5可看出，河套蜜瓜原種2個(gè)時(shí)期顯著差異表達(dá)的基因有13個(gè)，除了CmHB5以外，其余12個(gè)基因的表達(dá)量在M9的2個(gè)時(shí)期也呈顯著性差異。這12個(gè)基因分別是：CmETR2、CmETR3、CmCTR12、CmHB3、CmHB4、CmHB9、CmHB11、CmHB12、CmHB15、CmRIN2、CmRIN14、CmRIN15。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在河套蜜瓜原種中CmHB3和CmHB11生長期的表達(dá)量是成熟期的42，9倍，而CmHB4成熟期的表達(dá)量是生長期的27倍，其表達(dá)量均呈極顯著差異；在M9中CmHB3和CmHB11生長期的表達(dá)量是成熟期表達(dá)量的6,3倍，而CmHB4成熟期的表達(dá)量是生長期的41倍，其表達(dá)量均呈極顯著差異。

另外發(fā)現(xiàn)，在生長期2個(gè)材料間有5個(gè)基因呈顯著性差異表達(dá)，其中除了CmHB11基因外，其余3個(gè)基因的表達(dá)量在成熟期的2個(gè)材料間也呈顯著性差異，這3個(gè)基因分別是CmHB3、CmRIN14、CmRIN15，其中CmHB3、CmHB4的表達(dá)量呈極顯著差異。

10 d河套.河套蜜瓜原種生長期的果實(shí)；30 d河套.河套蜜瓜原種成熟期的果實(shí)；10 d M9.M9生長期的果實(shí)；30 d M9.M9成熟期的果實(shí)；不同小寫字母a,b,c,d代表存在顯著性差異；不同大寫字母A,B,C,D代表存在極顯著差異；字母相同則無差異。

10 d Hetao.Hetao melon fruit at growth stage; 30 d Hetao.Hetao melon fruit at ripening stage; 10 d M9.M9 fruit at growth stage; 30 d M9.M9 fruit at ripening stage; There was significant difference between a, b, c, d; There was highly significant difference between A, B, C, D; The same letters means no difference.

圖5 基因表達(dá)差異性分析
Fig.5 Difference analysis of gene expression

3 結(jié)論與討論

果實(shí)成熟的眾多調(diào)控因子中，乙烯被認(rèn)為是最關(guān)鍵的影響因子[16]。果實(shí)成熟時(shí)包括細(xì)胞壁代謝、類胡蘿卜素合成、葉綠素降解、芳香物質(zhì)、糖和有機(jī)酸合成等多個(gè)代謝途徑的相關(guān)基因都受乙烯調(diào)控[17]。乙烯通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)控植物體內(nèi)的生理活動(dòng)[18]。利用轉(zhuǎn)錄組測序的方法對目標(biāo)基因家族的表達(dá)量檢測具有成本低、高通量的優(yōu)勢，是目前挖掘功能基因的主要手段之一[19]。本研究選取在果實(shí)發(fā)育和成熟中已報(bào)道的4個(gè)相關(guān)基因作為目標(biāo)基因，在甜瓜基因組中鑒定獲得其家族成員。對這些基因在河套蜜瓜原種和M9品系不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)CmETR家族成員在成熟過程的表達(dá)水平在河套蜜瓜原種和M9中都呈下調(diào)趨勢。Ciardi等[20]發(fā)現(xiàn)乙烯受體在乙烯信號通路中是通過負(fù)調(diào)控來傳遞信號的，ETR的表達(dá)水平降低可提升植株對乙烯的敏感性。此外，CmCTR12基因在果實(shí)發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)，且后期呈下調(diào)模式，這與姚遠(yuǎn)等[21]在甜瓜中克隆的Cm-CTR1基因具有相同的表達(dá)模式。

本研究中13個(gè)基因在河套蜜瓜原種的2個(gè)時(shí)期存在顯著差異表達(dá)，12基因在M9的2個(gè)時(shí)期存在顯著差異表達(dá)，其中CmHB3和CmHB11呈下調(diào)表達(dá)模式且不同時(shí)期的表達(dá)量存在極顯著差異，推測其可能在生長期起作用；而CmHB4呈上調(diào)表達(dá)模式且不同時(shí)期的表達(dá)量存在極顯著差異，推測其可能在成熟期發(fā)揮作用。在生長期的河套蜜瓜原種和M9中，5個(gè)基因的表達(dá)量存在顯著差異，其中CmHB3和CmHB11的表達(dá)量在不同材料間存在極顯著差異；而在成熟期的河套蜜瓜原種和M9中，4個(gè)基因的表達(dá)量在2個(gè)材料間存在顯著差異，其中CmHB3和CmHB11的表達(dá)量在不同材料間存在極顯著差異，推測在果實(shí)發(fā)育過程中CmACO1的表達(dá)影響CmHB3和CmHB11的表達(dá)水平。番茄中LeHB1基因表達(dá)的抑制導(dǎo)致LeACO1基因的表達(dá)也降低[9]，而本研究中發(fā)現(xiàn)CmHB3和CmHB112個(gè)基因在轉(zhuǎn)反義CmACO1基因的材料中的表達(dá)量顯著低于河套蜜瓜原種，暗示甜瓜中CmACO1基因的表達(dá)也影響CmHB基因的表達(dá)水平。另外，CmRIN14和CmRIN15的表達(dá)量在河套蜜瓜原種和M9中存在截然相反的情況，表明其表達(dá)模式受CmACO1表達(dá)水平的影響。