李天賦，夏西洋，衛(wèi)海，高亭亭，龍偉，周文柏，陳莉

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州婦幼保健院1.生殖醫(yī)學(xué)中心，2.中心實驗室，江蘇 常州213003）

據(jù)WHO統(tǒng)計，全球約有6 000萬人無法生育，占育齡人口的15%左右，其中約45%是由男性因素造成［1］。隨著輔助生育技術(shù)的發(fā)展，對男性不育的認(rèn)識也逐漸加深，傳統(tǒng)的精液分析已不能滿足臨床需求，更多評估男性生育力的指標(biāo)得到專家的重視。精子作為遺傳信息的載體，其完整性對生育后代具有重要意義，精子DNA損傷作為一個反映精子質(zhì)量的新指標(biāo)，逐漸應(yīng)用于臨床［2］。精子DNA損傷是精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常的一個重要特征，是造成男性不育、復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)以及輔助生殖技術(shù)治療失敗的重要原因之一［3-4］。本研究擬通過測定精子DNA碎片化指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI），分析精子DNA損傷對體外受精 胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）結(jié)局的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年3月至2018年3月在常州市婦幼保健院生殖中心就診夫婦為研究對象。女方入組條件：①年齡≤35周歲；②確診為輸卵管因素導(dǎo)致不孕；③無其他婦科疾?。虎芷渌黜棾Ｒ?guī)檢查無異常（如性激素6項、子宮附件B超、免疫抗體指標(biāo)、病原體感染指標(biāo)等）。男方入組條件：①年齡≤38周歲；②精液常規(guī)檢查無明顯異常；③排除梗阻性無精子癥、Y染色體微缺失、生殖系統(tǒng)感染等疾病。所有研究對象夫妻雙方染色體核型檢測均正常，且均為首次進(jìn)行IVF-ET治療。

1.2 標(biāo)本收集與處理

要求男方禁欲3～7 d后在醫(yī)院取精室通過手淫方法留取精液。置于室溫液化，記錄精液體積，取部分液化后精液做精液常規(guī)、形態(tài)及精子DFI檢測。常規(guī)取2 mL充分液化精液采用ISOLATE梯度液（美國IrvineScientific公司）進(jìn)行密度梯度離心法處理：吸取1 mL上層離心液加入離心管底部，然后吸取1 mL下層離心液緩慢加于上層離心液之上。吸取液化后的精液緩慢加于最上層，每一步驟注意界面清晰。放入離心機(jī)以475×g離心15 min后，吸取底部的白色沉淀加入3 mL配子培養(yǎng)液（G-IVF PLUS，Vitrolife公司）中混合均勻，再以370×g離心9 min，棄上清液，留0.5 mL沉淀混勻，延管壁緩慢加入適量配子培養(yǎng)液，進(jìn)一步使用上游法優(yōu)選精子。

1.3 精子DNA損傷檢測

采用流式細(xì)胞儀和精子核完整性染色試劑盒（浙江星博生物科技公司），通過精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗（SCSA）進(jìn)行DFI檢測。①平衡樣品線：于流式細(xì)胞儀的樣品管中加入400μL的B液和1.2 mL C液混合成平衡緩沖液，上樣，使其在流式細(xì)胞儀的樣品線運行15 min，以確保染色液與進(jìn)樣管相平衡。②顯微鏡下觀察精子并計數(shù)。③根據(jù)計數(shù)的精子濃度，取一定量精子用A液稀釋至100μL，終濃度為（1～2）×106個／mL的精子細(xì)胞。④在流式細(xì)胞儀的進(jìn)樣管中加入100μL上述稀釋好的樣本。⑤加入200μL的B液（細(xì)胞置于冰上操作），準(zhǔn)確計時30 s之后，加入600μL C液。⑥將已經(jīng)染好色的樣品加入樣品室，立即啟動樣品流。⑦檢測精子的流動速度2 min后開始收集數(shù)據(jù)，至少有5 000個細(xì)胞的測定值加以記錄和統(tǒng)計。

精子核經(jīng)過酸處理液處理后，再經(jīng)吖啶橙染色。異常精子核染色質(zhì)為單鏈，與吖啶橙結(jié)合發(fā)橙黃色或紅色熒光；正常精子核染色質(zhì)為雙鏈，與吖啶橙結(jié)合發(fā)綠色熒光。若紅光（值）比例增高，說明精子核完整性程度降低。利用統(tǒng)計軟件計算DFI值［紅色熒光／（紅色熒光+綠色熒光）］。以DFI值＜15%、15%～30%、＞30%將患者分成正常組、低損傷組、高損傷組。

1.4 女方IVF方案

從月經(jīng)周期的第21天（排卵后1周或者服用避孕藥后19天）開始注射短效醋酸曲普瑞林（達(dá)必佳），給藥后第14-16天開始加用促性腺激素藥物（果納芬）進(jìn)行促排卵，整個促排卵過程需要9～12 d，直到卵泡成熟，然后注射人絨毛膜促性腺激素（hCG），36～38 h后取卵。

1.5 胚胎實驗室和臨床結(jié)局觀察指標(biāo)

統(tǒng)計獲卵數(shù)，于取卵后當(dāng)天進(jìn)行體外受精，16～18 h后觀察受精情況，見到兩個原核細(xì)胞為正常受精，受精率＝受精數(shù)／獲卵數(shù)；體外受精后第3天觀察胚胎卵裂情況，計算卵裂率＝卵裂數(shù)／受精數(shù)。統(tǒng)計優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，得到優(yōu)胎率＝優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)／卵裂數(shù)。受精后第5天觀察囊胚情況，統(tǒng)計囊胚形成率＝可用囊胚數(shù)／卵裂數(shù)。本研究所有入組方案，均進(jìn)行凍胚移植，移植第35天，進(jìn)行B超檢查確定是否妊娠，妊娠率＝妊娠數(shù)／每組人數(shù)，追蹤病例至妊娠結(jié)束，統(tǒng)計流產(chǎn)率＝流產(chǎn)數(shù)／妊娠數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，3組計量資料符合正態(tài)分布，以±s表示，3組間獲卵數(shù)、正常受精率、卵裂率、優(yōu)胎率、囊胚形成率比較均選用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；妊娠率、流產(chǎn)率比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

共收集158對患者，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，并力爭減少組間差異，最終納入90對病例。3組之間男女雙方年齡、男方精液常規(guī)指標(biāo)、女方獲卵數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 胚胎實驗室指標(biāo)與臨床結(jié)局比較

3組間受精率、卵裂率均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與正常組相比，高損傷組的優(yōu)胎率和囊胚形成率明顯降低（P＜0.05），低損傷組的囊胚形成率明顯降低（P＜0.05）。移植第35天B超及回訪追蹤妊娠結(jié)局顯示，與正常組相比，高損傷組的妊娠率明顯降低（χ2＝4.356，P＜0.05）；而3組間的流產(chǎn)率則無明顯差異（χ2＝0.078，P＞0.05）。見表2、表3。

表1 3組患者一般情況比較

表2 3組實驗室觀察指標(biāo)比較

表3 3組臨床結(jié)局指標(biāo)比較

3 討論

精子DNA承載了男性的遺傳物質(zhì)，其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)關(guān)系到精子的受精能力、胚胎發(fā)育情況以及臨床妊娠能否順利進(jìn)行［5］。精子DNA損傷導(dǎo)致的精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常，是引起男性不育、輔助生殖治療失敗、反復(fù)流產(chǎn)的重要原因。造成精子DNA損傷的因素很多，各種原因?qū)е碌木有纬蛇^程中的細(xì)胞凋亡、氧自由基產(chǎn)生、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及染色質(zhì)包裝異常等［6-8］，都可能影響精子DNA的完整性。另外，環(huán)境污染、全身其他系統(tǒng)疾病、生活方式、藥物使用等也會引起精子DNA的損傷［9］。

目前檢測精子DFI的實驗方法很多，主要包括：末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法（TUNEL）、精子染色體擴(kuò)散實驗（SCD）、精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗（SCSA）、單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE）、熒光原位雜交技術(shù)（FISH）、基因芯片技術(shù)等。SCD法方便快捷，但受實驗人員主觀操作影響較大，且無法評估受損程度；TUNEL法敏感性高，結(jié)果準(zhǔn)確，但操作復(fù)雜，成本較高且缺乏臨床標(biāo)準(zhǔn)化流程；SCSA具有較高敏感性和可重復(fù)性，各臨床中心目前大多使用此法，但最近有學(xué)者指出該方法存在設(shè)門隨意、計算方法有誤等問題［10］。本研究使用的是目前各大生殖中心普遍采用的SCSA法，該方法檢測方便、檢測結(jié)果可以被其他中心認(rèn)可，目前仍是精子DFI檢測的首選方法。

一項薈萃分析指出，檢測精子DNA損傷的方法與受精率、卵裂率等實驗室指標(biāo)無明顯相關(guān)［11］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，精子DNA損傷與男性生育能力呈負(fù)相關(guān)性，影響自然生育能力，但與受精率、妊娠率無明顯相關(guān)性［12-13］；同時有多項研究表明，DFI與受精能力、胚胎發(fā)育、臨床妊娠結(jié)局以及輔助生殖技術(shù)治療效果呈顯著相關(guān)［14-15］。正常精子率作為男性精液檢查一項重要項目，與DFI的關(guān)系也存在爭議［6，16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，低損傷組和高損傷組的精液濃度、前向運動能力、正常精子率均無明顯差異。同時，3組間的受精率、卵裂率也無統(tǒng)計學(xué)差異，原因可能與胚胎發(fā)育初期主要受卵子DNA調(diào)控有關(guān)［18］。而優(yōu)胎率、囊胚形成率、妊娠率這幾項指標(biāo)，高損傷組明顯低于正常組，說明父源性DNA在胚胎發(fā)育過程中逐漸開始發(fā)生作用，并最終影響了臨床結(jié)局。本研究中3組的流產(chǎn)率無明顯差異，可能與每組流產(chǎn)數(shù)過低有關(guān)。

綜上所述，精子DNA損傷指標(biāo)DFI對臨床判斷男性生育能力、預(yù)判輔助生育結(jié)局具有一定的指導(dǎo)意義，因此建議各醫(yī)院男科以及生殖中心開展此類檢查。同時期待有更標(biāo)準(zhǔn)化的DFI檢測技術(shù)流程，以降低檢測過程中人為因素造成的DFI偏差所帶來的臨床不良結(jié)局。