魏茜雪，秦雪，陳青青，嚴麗梅

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦科，遼寧 沈陽110004）

已有研究表明，miRNA可能通過調節(jié)基因調節(jié)宮頸癌的發(fā)生、生長和進展的各個階段［1］。在眾多調節(jié)癌癥的miRNA中，miR-664涉及癌細胞發(fā)生、腫瘤生長、分化和癌細胞凋亡的許多方面。肝細胞癌中的miR-664上調，下調miR-664能抑制肝癌生長［2］。在乳頭狀甲狀腺癌和散發(fā)性乳腺癌中miR-664顯著下調，但其功能作用尚不清楚［3］。本研究擬探討miR-664在宮頸癌組織和細胞株中的表達水平及對順鉑化療敏感性的影響及其機制，為宮頸癌的診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2011年5月至2014年7月在我院婦科行手術治療并經(jīng)病理證實的宮頸癌患者142例，年齡為40～74歲，平均（57.5±17.8）歲，病程為9個月～4年，其中絕經(jīng)后患者79例，平均絕經(jīng)年限8年。142例中，鱗癌82例、腺癌60例；人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）陽性114例。所有患者行輔助檢查：血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、宮頸病理組織檢查。病理分期采用TNM分期（AJCC癌癥分期手冊）。所有病例均符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)（NCCN）公布的2012版宮頸癌診斷標準［4］。將手術切除標本進行病理學檢查以判定臨床病理學特征。同時取距宮頸癌組織3 cm以上的宮頸組織作為癌旁組織?；颊呔栽柑峁┱m頸組織及宮頸癌組織標本進行miR-664表達的檢測。

1.2 細胞株、主要儀器與試劑

Hela-229細胞（上海栩冉生物科技有限公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen），胰酶（美國Gibco公司），四甲基偶氮唑藍（北京廣源恒信科技發(fā)展有限公司），miR-664擬似物（上海伯豪生物技術有限公司），吖啶橙（碧云天生物技術公司），胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），二甲基亞砜（99.9%，美國Sigma公司），Transcriptor first strand cDNA synthesis kit（日本TaKaRa公司），實時熒光定量PCR儀（美國熱電公司），One Step PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒（日本TaKaRa公司），SYBR Premix Ex Taq II（日本TaKaRa公司），NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀（美國Thermo公司），BD BiocoatTMMatrigelTM基質（上海偉進生物科技有限公司），聚碳酸酯孔濾膜（上海正晃商貿有限公司），Caspase-3、Caspase-9濃度檢測ELISA試劑盒（上海伯豪生物技術有限公司），MK3酶標儀（美國Thermo公司）。

1.3 qRT-PCR檢測宮頸癌組織及癌旁組織miR-664的表達

采用Trizol試劑從宮頸癌組織和癌旁組織中提取總RNA。使用One Step PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，并使用SYBR Premix Ex Taq II進行定量實時PCR。使用內源性U6小核RNA（U6）進行標準化（U6正向引物，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′； 反 向，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′）。通 過2-ΔΔCT方 法 計 算miR-664相對表達水平。PCR引物序列：miR-664正向引物，5′-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3′，反向引物，5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′。反應體系：正向引物10μL、反向引物10μL、RNA模版0.6μL、超級酶混合物0.2μL、qRT-PCR緩沖液5 μL、去RNA水3.4μL。循環(huán)如下：95℃持續(xù)10 min，進行40個循環(huán)，60℃持續(xù)15 s。根據(jù)miR-664表達水平，≤0.95為陰性，＞0.95為陽性［5］。

1.4 細胞復蘇培養(yǎng)及Hela-229細胞miR-664擬似物轉染

將宮頸癌Hela-229細胞株加入到含1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640中，置于37℃、5%CO2、20%O2培養(yǎng)箱。當細胞融合率達到80%時，用0.5%胰蛋白酶消化傳代。

將10 mL Hela-229癌細胞液接種于6孔板，取100 pmol的miR-664擬似物加入到200μL DMEM培養(yǎng)基中，另外取4μL Lipofectamine2000加入，混勻lipofectamine2000和miRNA 液，室溫培育30 min，將混合液加入6孔板中，無菌PBS洗滌細胞，6 h后棄混合液，加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，流式細胞儀檢測轉染效率。

1.5 細胞分組

將Hela-229細胞分為3組。對照組：取10 mL（5×106）Hela-229細胞液加入到含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、20% O2）；順鉑組：在與對照組相同量培養(yǎng)液與細胞液中，加入順鉑（5μmol／L）5 mL；順鉑+轉染組：取10 mL轉染miR-664的Hela-229細胞液，加入順鉑（5μmol／L）5 mL，置于CO2培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2、20% O2）。以上各組每孔設6個平行樣，培養(yǎng)72 h。

1.6 MTT法檢測Hela-229細胞活力及癌細胞單克隆形成數(shù)目檢測

將各組Hela-229細胞液接種于6孔板，每孔加入MTT溶液（5 mg／mL）10μL，37℃恒溫箱孵育4 h，加入150μL的二甲基亞砜，采用酶標儀于490 nm波長處檢測光密度（D）值。將細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM（12孔板，1×103細胞／孔，每孔設6個平行樣）。培養(yǎng)5 d后，用亞甲藍染色細胞，倒置顯微鏡計數(shù)成像區(qū)域中的菌落形成數(shù)目（×400）。

1.7 流式細胞術檢測Hela-229細胞株凋亡及細胞周期

將Hela-229細胞培養(yǎng)72 h后，通過胰蛋白酶消化收集細胞。然后將細胞用膜聯(lián)蛋白Ⅴ-FITC和PI溶液在黑暗中染色15 min。最后，采用流式細胞術檢測細胞凋亡及細胞周期。

1.8 Transwell細胞遷移實驗

將2 mm厚的Matrigel凝膠（8.2 g／L）均勻平鋪于聚碳酸酯微孔濾膜上，3組Hela-229細胞液（細胞密度為5×106／mL）各取60μL加入小室，并加入1 000μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；室溫培育12 h后，使用無菌醫(yī)用棉簽輕微刮除濾膜小室的細胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色30 min。高倍鏡下選取中心和四周各5個視野，計數(shù)每個視野內穿過8μm微孔的細胞數(shù)。

1.9 qRT-PCR檢測Hela-229細胞miR-664表達

上述3組Hela-229細胞培養(yǎng)結束后，無菌收集細胞。取5 mL細胞液（細胞密度為5×106／mL），5 000 r／min離心5 min，-70℃凍存?zhèn)溆?。qRTPCR檢測miR-664表達水平，方法同“1.3”。

1.10 ELISA 法檢測Hela-229細胞培養(yǎng)液中Caspase-3、Caspase-9的濃度

Hela-229細胞培養(yǎng)72 h后，5 000 r／min離心收集各組細胞，加入PBS制成細胞懸液后，采用ELISA法測定培養(yǎng)液中Caspase-3、Caspase-9的質量濃度。具體步驟按試劑盒說明書進行。

1.11 統(tǒng)計分析

采用Epidata、SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行錄入、統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用卡方檢驗，檢驗水準α為0.05。

2 結果

2.1 宮頸癌組織中miR-664表達量

qRT-PCR檢測結果顯示，宮頸癌組織中miR-664相對表達量為0.95±0.38，明顯低于癌旁正常組織（3.53±0.09，t＝78.728，P＜0.01）。

2.2 miR-664表達與臨床病理特征的關系

表1可見，miR-664表達與年齡相關性不明顯（P＞0.05）；與TNM分期、病理學分級、復發(fā)、淋巴結轉移相關性明顯，且TNM分期越高、病理學分期越高、有復發(fā)、有淋巴結轉移者miR-664陽性表達率越低（均P＜0.01）。

2.3 各組Hela-229細胞miR-664表達水平比較

qRT-PCR檢測結果顯示，順鉑組、順鉑+轉染組miR-664的表達均明顯高于對照組（均P＜0.01），順鉑+轉染組miR-664表達也顯著高于順鉑組（P＜0.01）。見圖1。結果表明miR-664轉染成功，順鉑能誘導miR-664高表達。

2.4 各組Hela-229細胞存活率

MTT檢測結果顯示，順鉑組、順鉑+轉染組細胞存活率分別為（42.01±8.24）%、（24.36±3.21）%，均明顯低于對照組［（78.52±8.25）%，F(xiàn)＝19.369，P＜0.01］；而順鉑+轉染組細胞存活率又顯著低于順鉑組（t＝21.159，P＜0.01）。結果表明，miR-664能抑制Hela細胞的增殖。

表1 miR-664 RNA表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系

圖1 各組Hela-229細胞miR-664表達量比較

2.5 各組Hela-229細胞單克隆形成數(shù)目

Transwell實驗結果顯示，順鉑組、順鉑+轉染組細胞單克隆形成數(shù)目均顯著低于對照組（P＜0.01），順鉑+轉染組細胞單克隆形成數(shù)目又明顯低于順鉑組（P＜0.01）。見圖2。

2.6 各組Hela-229細胞凋亡率比較

流式細胞術檢測結果顯示，順鉑組、順鉑+轉染組細胞凋亡率均顯著高于對照組（均P＜0.01），順鉑+轉染組細胞凋亡率又明顯高于順鉑組（P＜0.01）。見圖3。

圖2 各組Hela-229細胞單克隆形成數(shù)目

2.7 各組Hela-229細胞G1期比較

順鉑組、順鉑+轉染組G1期細胞比例分別為（55.88±0.95）%、（45.43±0.84）%，均顯著低于對照組［（67.96±1.06）%，均P＜0.01］；順鉑+轉染組G1期細胞比例又顯著低于順鉑組（P＜0.01）。見圖4。

2.8 各組Hela-229細胞穿膜數(shù)比較

Transwell細胞遷移實驗結果顯示，順鉑組、順鉑+轉染組細胞穿膜數(shù)均明顯低于對照組（均P＜0.01），順鉑+轉染組細胞穿膜數(shù)又顯著低于順鉑組（P＜0.01）。見圖5。

2.9 各組Hela-229細胞培養(yǎng)液Caspase-3、Caspase-9濃度比較

ELISA檢測結果顯示，順鉑組、順鉑+轉染組細胞培養(yǎng)液中的Caspase-3、Caspase-9質量濃度均顯著高于對照組（均P＜0.01），而順鉑+轉染組細胞培養(yǎng)液Caspase-3、Caspase-9濃度又顯著高于順鉑組（P＜0.01）。見表2。

圖3 流式細胞術檢測各組Hela-229細胞凋亡率

圖4 各組Hela-229細胞G1期比較

圖5 各組Hela-229細胞穿膜數(shù)的比較

表2 各組Hela-229細胞培養(yǎng)液Caspase-3、Caspase-9濃度n＝6

3 討論

肝癌體外實驗表明，NF-κB p65可直接抑制miR-664的轉錄、表達，進而間接抑制肝癌細胞的遷移和侵襲［6］。此外，在人乳腺癌細胞中，miR-664可抑制Raf激酶蛋白（RKIP）轉移相關基因的表達進而抑制細胞的侵襲［7-9］。本研究結果顯示，宮頸癌組織miR-664表達明顯低于癌旁組織，miR-664與TNM分期、病理學分級、復發(fā)、淋巴結轉移明顯相關，且TNM分期越高、病理學分期越高、有復發(fā)、有淋巴結轉移病例miR-664表達越低。本實驗結果說明miR-664過表達能抑制宮頸癌細胞增殖、浸潤，這與上述文獻中miR-664抑制肝癌細胞的遷移和侵襲相符合。最近的研究表明，miR-664通過促進細胞凋亡，抑制淋巴管生成和血管生成，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用［7］。多項研究顯示，miR-664在多種腫瘤中表達下調，miR-664低水平表達與不同癌癥的進展相關［2］。上述結果提示miR-664在腫瘤進展和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮關鍵調控作用。

細胞學實驗表明，miR-664抑制腸癌細胞增殖的分子機制與 G1-S相變的加速，p21Cip1 和p27Kip1的下調以及細胞周期蛋白D1的上調有關［10］。miR-664的低表達是PI3K／AKT信號轉導以及細胞周期進展至G1期的必要條件。此外，PI3K／AKT的激活增加p21Cip1和p27Kip1的細胞水平，并抑制細胞周期蛋白D1的表達，從而抑制細胞增殖［11］。金屬基質酶的失調導致細胞外基質增加，這是許多腫瘤局部侵襲和轉移的關鍵步驟。miR-664能抑制金屬基質酶活性，表明miR-664在癌癥的生物療法中具有優(yōu)勢。miR-664抑制癌細胞侵襲，具有用于癌癥基因治療的潛在優(yōu)勢，表達miR-664可誘導肺癌細胞凋亡，上調p53、Fas配體、TNFR1和TNFR2的表達，促進肺癌治療效果［12］。研究表明，miR-664可通過Caspase依賴性途徑誘導細胞凋亡，miR-664的過度表達可誘導細胞色素c的釋放并激活Caspase-8和Caspase-9途徑，兩者均導致癌細胞凋亡［13］。miR-664還可通過Fas相關依賴途徑誘導細胞凋亡途徑［14］。這一事實表明miR-664可能通過p53途徑間接誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，順鉑組、順鉑+轉染組細胞存活率、單克隆形成數(shù)目、G1期細胞比例、細胞穿膜數(shù)均明顯低于對照組，細胞凋亡率、Caspase-3、Caspase-9濃度顯著高于對照組；順鉑+轉染組細胞存活率、單克隆形成數(shù)目、G1期細胞數(shù)、細胞穿膜數(shù)又顯著低于順鉑組，細胞凋亡率、Caspase-3、Caspase-9濃度明顯高于順鉑組。該結果說明miR-664能增強順鉑對宮頸癌細胞的化療敏感性，明顯抑制癌細胞增殖、遷移和浸潤，其機制可能與其加速宮頸癌癌細胞凋亡、G1進程以及Caspase-3、Caspase-9過表達有關。