林立萍，張連璐，易周易，趙雅聞，李雪，唐浩，黃新祥，張盈

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013）

傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi）是一種革蘭陰性兼性胞內(nèi)寄生兼性厭氧菌，感染機(jī)體后可以引起胃腸炎或傷寒［1］。S.Typhi感染過程分為兩個(gè)階段：細(xì)菌黏附并侵入小腸上皮細(xì)胞，為腸道感染階段；細(xì)菌進(jìn)入上皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞內(nèi)，然后在胞內(nèi)復(fù)制，為細(xì)胞內(nèi)感染階段［2-3］。該過程所需的相關(guān)基因位于沙門菌致病島（salmonella pathogenicity island，SPI）。S.Typhi表達(dá)兩個(gè)不同的Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS），能在感染后將效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞：一個(gè)是SPI-1，其效應(yīng)蛋白與細(xì)菌和宿主細(xì)胞的黏附有關(guān)，可引起腸黏膜細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白發(fā)生重排，有利于S.Typhi內(nèi)化［4］，能夠促進(jìn)沙門菌進(jìn)入和侵襲上皮細(xì)胞。另一個(gè)是SPI-2，其在吞噬細(xì)胞內(nèi)具有活性，且為吞噬體生存所必需。以往研究表明［5］，EnvZ／OmpR雙組分系統(tǒng)參與SPI-1基因表達(dá)的調(diào)控，OmpR-P能夠直接與hilC和hilD啟動(dòng)子結(jié)合，激活前者并且抑制后者基因的表達(dá)，從而影響S.Typhi對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲力。本研究利用ompR缺陷株（ΔompR），分析OmpR對(duì)S.Typhi侵襲上皮細(xì)胞能力的影響，并進(jìn)一步選擇SPI-1中3個(gè)操縱子首基因iagA、invF、prgH，研究其相關(guān)分子機(jī)制以探討OmpR在S.Typhi侵襲過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

S.Typhi野生株GIFU10007（WT）為日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈(zèng)。S.Typhi的ΔompR菌株由本實(shí)驗(yàn)室制備及保存［6］。大腸埃希菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。HeLa細(xì)胞購自上海生科院細(xì)胞庫。

胰蛋白胨、酵母提取物、氯霉素、胰蛋白酶、胎牛血清（英國(guó)Oxoid公司）；無水乙醇、異丙醇（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；SYBR熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA酶Ⅰ快速DNA消化試劑盒、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DL 2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物（大連TaKaRa公司）；凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）上樣緩沖液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）。

2720型PCR儀（美國(guó)ABI公司）；核酸紫外檢測(cè)儀（Eppendorf公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Biorad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（基因有限公司）；電轉(zhuǎn)化儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機(jī)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物 實(shí)驗(yàn)中所用引物由蘇州泓訊生物科技有限公司合成，序列見表1（下劃線示酶切位點(diǎn)）。

表1 引物名稱及相應(yīng)序列

1.2.2 ompR基因缺失回補(bǔ)株的制備 以WT基因組DNA作為模板，以ompR-C-F／R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并純化回收；利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和Hin dⅢ對(duì)上述PCR產(chǎn)物和載體pBAD33質(zhì)粒純化產(chǎn)物分別行酶切處理，用DNA連接酶進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含氯霉素的LB平板進(jìn)行篩選，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落過夜培養(yǎng)，苯酚和氯仿抽提各菌落基因組行電泳鑒定，初步篩選陽性克隆。提取所篩選的質(zhì)粒，以內(nèi)部引物對(duì)ompR-C-F和ompR-C-R、交叉引物對(duì)ompR-C-F和pBAD33-R分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步驗(yàn)證陽性質(zhì)粒是否連接目的片段。經(jīng)PCR驗(yàn)證正確后，經(jīng)基因序列分析（由蘇州泓訊生物科技有限公司完成）驗(yàn)證。提取序列正確的重組質(zhì)粒（ompRpBAD33），并將其電轉(zhuǎn)入ΔompR中，即可得ompR基因缺失回補(bǔ)株（記為C-ΔompR）。同時(shí)將空載體pBAD33轉(zhuǎn)入WT和ΔompR中作為相應(yīng)的對(duì)照株（分別記為WT-pBAD33和ΔompR-pBAD33）。

1.2.3 HeLa細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)前1 d將細(xì)胞以1×105／mL密度接種于24孔中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。將WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33和C-ΔompR于20 mL LB培養(yǎng)基中，250 r／min，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期［D（600 nm）＝0.4］。按照MOI為20∶1的比例向細(xì)胞中加入細(xì)菌，孵育90 min；棄上清液，PBS洗3次。一半孔內(nèi)加入0.5%（v／v）Triton X-100裂解細(xì)胞，孵育12 min后涂于LB平板，培養(yǎng)過夜，其克隆數(shù)代表黏附水平（以T0表示）；余下一半孔內(nèi)加入100 μg／mL慶大霉素殺死胞外菌，繼續(xù)培養(yǎng)90 min后同樣加入0.5%（v／v）Triton X-100裂解細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，計(jì)算單克隆數(shù)代表侵襲水平（以T90表示）；重復(fù)3次后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)侵襲相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平 選擇SPI-1中3種侵襲相關(guān)基因iagA、invF、prgH行qRT-PCR分析。將WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33單菌落分別接種于2 mL LB培養(yǎng)基，37℃、250 r／min振蕩培養(yǎng)過夜。次日，將種子液以1∶100比例轉(zhuǎn)接至20 mL LB，相同條件培養(yǎng)至穩(wěn)態(tài)期［D（600 nm）＝2.0］。將培養(yǎng)的WT-pBAD33和ΔompR-pBAD33于4℃行4 000 r／min離心收集沉淀。Trizol法提取細(xì)菌總RNA，使用DNA酶ⅠDNA消化試劑盒消化基因組DNA。取1 μg總RNA，以特異性下游引物和反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，用上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，采用兩步法qRT-PCR（95℃預(yù)變性150 s，95℃10 s，65℃30 s，40個(gè)循環(huán)），其中16 SrRNA為內(nèi)參基因（引物見表1），觀察相關(guān)基因在各菌株中的轉(zhuǎn)錄水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；Bio-Rad CFX Manager軟件整理和分析數(shù)據(jù)，利用相對(duì)定量法確定mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 EMSA 以WT基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增iagA、invF、prgH基因啟動(dòng)子區(qū)序列并純化，16 S DNA用作陰性對(duì)照（引物見表1）。在結(jié)合緩沖液中加入20 mmol／L新鮮乙酰磷酸鹽，并與純化的His-OmpR蛋白一起室溫放置10 min以實(shí)現(xiàn)OmpR磷酸化；結(jié)合體系配制完成后，分別加入1μL DNA片段于30℃溫育30 min；產(chǎn)物行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后用溴化乙啶染色，于凝膠成像儀顯影后分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C-△ompR制備

2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 PCR擴(kuò)增獲得752 bp ompR目的片段（圖1a）。以內(nèi)部引物對(duì)和交叉引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選陽性克隆，相應(yīng)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與理論值（分別為752 bp和802 bp）一致（圖1b）；挑取PCR鑒定正確的克隆經(jīng)基因序列分析驗(yàn)證，該質(zhì)粒所連接的目的片段不存在缺失、插入等突變，表明重組載體構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

2.1.2 C-△ompR的驗(yàn)證 以C-ΔompR基因組為模板的擴(kuò)增片段與理論值（分別為802 bp、874 bp和924 bp）一致；而以雙蒸水為模板均擴(kuò)增不出條帶，表明陽性重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入ΔompR中，回補(bǔ)株制備成功。見圖2。

圖2 回補(bǔ)株P(guān)CR鑒定凝膠電泳圖

2.2 OmpR增強(qiáng)S.Typhi侵襲上皮細(xì)胞的能力

如圖3所示，與WT-pBAD33相比，ΔompRpBAD33對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲能力顯著下降，而CΔompR侵襲能力較ΔompR-pBAD33明顯升高（P均＜0.01），說明OmpR可促進(jìn)S.Typhi對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲。

2.3 OmpR增加侵襲相關(guān)基因的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，ΔompR-pBAD33中侵襲相關(guān)基因iagA、invF、prgH的轉(zhuǎn)錄水平較WT-pBAD33明顯降低（P均＜0.01，圖4）。由此表明，OmpR正向調(diào)控S.Typhi侵襲上皮細(xì)胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

圖3 ompR缺陷對(duì)S.Typhi侵襲上皮細(xì)胞能力的影響

圖4 OmpR對(duì)侵襲相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4 OmpR直接和prgH啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合

EMSA結(jié)果顯示（圖5），His-OmpR以劑量依賴性方式與prgH的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，但其與iagA和invF基因啟動(dòng)子區(qū)域以及陰性對(duì)照16 SDNA未有結(jié)合。

圖5 Omp R直接和prgH啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合

3 討論

S.Typhi是一種原核生物，可引起人類全身系統(tǒng)性感染——傷寒熱［7］。S.Typhi感染機(jī)體引起疾病的過程很大程度上依賴于其通過污染的食物和水經(jīng)消化道感染宿主，進(jìn)入宿主后侵入腸上皮細(xì)胞并在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力［8］。S.Typhi的致病能力與多種侵襲、菌毛、鞭毛基因以及調(diào)節(jié)因子等相關(guān)，其中影響入侵過程的主要毒力因子由SPI-1編碼。

OmpR是雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)EnvZ／OmpR的調(diào)節(jié)蛋白，是一種中央調(diào)節(jié)因子，其經(jīng)傳感器激酶EnvZ磷酸化激活，由此產(chǎn)生的OmpR-P調(diào)節(jié)許多具有不同細(xì)胞途徑的基因［9］，如外膜孔蛋白、鞭毛基因、菌毛以及Vi抗原。以往研究表明［6，10-11］，在SPI-1編碼的4種AraC樣轉(zhuǎn)錄因子HilA，HilC，HilD和InvF中，OmpR-P能夠直接與hilC和hilD啟動(dòng)子結(jié)合，激活前者并且抑制后者，HilC和HilD控制自身與其轉(zhuǎn)錄，并一起激活hilA轉(zhuǎn)錄，HilA進(jìn)一步激活invF的轉(zhuǎn)錄，從而影響S.Typhi對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲力。本文以ompR基因作為研究對(duì)象，構(gòu)建了回補(bǔ)株CΔompR，對(duì)OmpR在S.Typhi侵襲上皮細(xì)胞中的功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ompR的缺失能顯著降低S.Typhi對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲能力，而C-ΔompR侵襲能力只是部分恢復(fù)，可能與回補(bǔ)基因的表達(dá)量有關(guān)。

SPI-1中含有inv、hil、org、spt、sip、iag、iae、prg等基因［12］，編碼T3SS的各種成分，其中T3SS分泌裝置注射體的子結(jié)構(gòu)主要由3種完整的膜蛋白InvG，PrgH和PrgK組成［13］，它們通過形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)從而分泌各種成分。本實(shí)驗(yàn)選擇SPI-1中3個(gè)操縱子首基因iagA、invF、prgH，通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)OmpR可促進(jìn)這些侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步采用EMSA，通過在純化的His-OmpR蛋白中加入新鮮乙酰磷酸鹽，實(shí)現(xiàn)OmpR的體外磷酸化。結(jié)果顯示，OmpR-P可直接與prgH基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，與iagA和invF基因啟動(dòng)子區(qū)域未有結(jié)合。PrgH是T3SS分泌裝置注射體的組成部分，參與T3SS基座內(nèi)環(huán)的構(gòu)成。本研究結(jié)果表明OmpR可直接調(diào)節(jié)T3SS結(jié)構(gòu)相關(guān)基因的表達(dá)。

綜上所述，OmpR能夠通過直接調(diào)節(jié)prgH和間接調(diào)節(jié)iagA、invF增加侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)S.Typhi對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲力。然而，本研究結(jié)果雖表明prgH是OmpR的靶基因，但是OmpR與prgH的結(jié)合位點(diǎn)仍需進(jìn)一步確定。