閔玉嬌，吳皓杰，王薈，潘子輝，邵啟祥

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫學(xué)檢驗(yàn)教研室，江蘇 鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，江蘇 鎮(zhèn)江212001）

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)途徑是普遍存在于細(xì)胞中的一條重要信號(hào)途徑，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增殖和代謝［1-2］。mTOR 激酶分為雷帕霉素敏感的mTORC1和雷帕霉素不敏感的mTORC2。mTOR和mLST8均存在于兩種mTOR激酶中，此外mTORC1中還包含Raptor、PRAS40等分子。研究表明，mTORC1在個(gè)體、組織和細(xì)胞的生長發(fā)育和退化中發(fā)揮重要作用［3］。mTORC1與T細(xì)胞的發(fā)育分化關(guān)系密切，胸腺上皮細(xì)胞（thymic epithelial cells，TECs）作為構(gòu)成胸腺微環(huán)境的重要組分對(duì)T細(xì)胞的發(fā)育有很大影響。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)mTORC1可能參與TECs的退化過程（未發(fā)表），本研究擬通過構(gòu)建Raptor shRNA慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠胸腺上皮細(xì)胞系（mouse thymic epithelial cell line 1，mTEC1），敲降Raptor基因，觀察mTORC1在TECs中的作用，從而闡明TECs衰老和退化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

慢病毒載體質(zhì)粒pLKO.1-puro由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院、上海市免疫學(xué)研究所李斌教授惠贈(zèng)；ps-PAX2及PMD2.0G慢病毒包裝質(zhì)粒為我院龔愛華教授贈(zèng)予；感受態(tài)DH5α細(xì)菌由本實(shí)驗(yàn)室杜鳳移老師饋贈(zèng)；限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和Eco RⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和Lip2000為美國Thermo公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司；哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑RIPA購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑混合物為瑞士Roche公司產(chǎn)品；抗磷酸化mTOR（phosphomTOR，p-mTOR）、抗mTOR、抗Raptor、抗磷酸化核糖體S6激酶（phospho-p70S6k，p-p70S6k）、抗核糖體S6激酶總蛋白（t-p70S6k）和HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體均為美國CST公司產(chǎn)品；抗β-肌動(dòng)蛋白抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；ECL檢測(cè)試劑盒為德國Merck公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3 Raptor基因shRNA目的片段的合成

從Sigma網(wǎng)站檢索Raptor基因的shRNA序列，并在其5′端和3′端分別加入AgeⅠ和Eco RⅠ限制性核酸酶切位點(diǎn)序列，具體序列如下：正義鏈，5′-CCGGGCCCGAGTCTGTGAATGTAATCTCGAGATT ACATTCACAGACTCGGGCTTTTTG-3′；反義鏈，5′-A ATTCAAAAAGCCCGAGTCTGTGAATGTAATCTCGA GATTACATTCACAGACTCGGG-3′；由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 pLKO.1-puro慢病毒載體質(zhì)粒酶切

慢病毒載體質(zhì)粒pLKO.1-puro經(jīng)感受態(tài)DH5α細(xì)菌擴(kuò)增后，用限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切，體系如下：AgeⅠ2.5μL，Eco RⅠ2.5μL，pLKO.1-puro 2.5μg，緩沖液5μL，以無菌雙蒸水補(bǔ)足至50μL。酶切反應(yīng)條件：37℃4 h。

1.5 膠回收酶切后pLKO.1-puro載體

將“1.4”產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，并于長波紫外檢測(cè)儀中檢測(cè)，切取目的位置相應(yīng)的條帶并稱重。按照生工生物工程（上海）股份有限公司膠回收試劑盒操作步驟進(jìn)行膠回收。

1.6 載體酶切及與目的片段的連接

將Raptor基因shRNA目的片段的正義鏈與反義鏈1∶1混合，退火后按下述體系加樣，16℃連接過夜，將shRNA連接到膠回收的pLKO.1-puro載體中。體系如下：10×緩沖液2μL，pLKO.1-puro酶切純化載體1μL，Raptor shRNA目的片段16μL，T4連接酶1μL。

1.7 pLKO.1-puro-shRNA-Raptor轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌

取“1.6”中連接產(chǎn)物1μL加入感受態(tài)DH5α中，輕輕混勻置于冰上孵育30 min；42℃孵育90 s，期間勿搖動(dòng)EP管；休克結(jié)束后迅速移至冰上，加入LB液體培養(yǎng)基400μL，于37℃搖床250 r／min擴(kuò)增2 h；4 000 r／min室溫離心4 min，棄去一半上清液后混勻，將菌液均勻涂布于含有氨芐西林的LB固體平板上，37℃培養(yǎng)16 h；然后挑取單個(gè)菌落接種于含有氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床250 r／min孵育過夜。

1.8 質(zhì)粒的提取和測(cè)序

按照試劑盒說明書提取質(zhì)粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，分析shRNA序列（含AgeⅠ和Eco RⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)）是否正確，確認(rèn)是否成功構(gòu)建pLKO.1-puro-shRNA-Raptor載體。

1.9 病毒的包裝與感染

將HEK-293T細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度為70%且狀態(tài)良好時(shí)，加入6μg質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，即pMD2G、psPAX2和pLKO.1-puroshRNA-Raptor載體按質(zhì)量比1∶2∶3比例混勻，加入高糖DMEM至250 mL；同時(shí)另取高糖DMEM 232 mL，加入18μL Lip2000混勻，室溫靜置5 min；最后將含有質(zhì)粒的DMEM 加入至含有Lip 2000的DMEM中，混勻，室溫靜置20 min；加入到HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，補(bǔ)充培養(yǎng)基體系至3 mL，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h；棄培養(yǎng)液，加入3 mL含10%胎牛血清的無雙抗高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集培養(yǎng)上清液，用0.22μm除菌濾器過濾，即為病毒懸液；同時(shí)將轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基孵育24 h，再次收獲病毒懸液。將收獲的病毒懸液和含10%胎牛血清的DMEM以1∶1加入到匯合度為30%左右的mTEC1中，加入聚凝胺（5μg／mL）培養(yǎng)24 h；重復(fù)此步驟再次培養(yǎng)24 h后更換正常的無雙抗DMEM并加入嘌呤霉素（2～5 μg／mL）篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞。待細(xì)胞生長穩(wěn)定，完全抵抗嘌呤霉素后，收集部分細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行免疫印跡法鑒定，另一部分繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.10 免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)

將野生型mTEC1和穩(wěn)定感染shRNA-Raptor病毒的mTEC1以每孔2×105接種于6孔板，前者接種2孔，后者接種1孔，37℃5% CO2培養(yǎng)24 h，分別記作mTEC1組，shRNA-Raptor組。在其中1孔野生型mTEC1中以1∶1 000加入50μmol／L雷帕霉素，記作mTEC1-雷帕霉素組。繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集各組細(xì)胞提取蛋白；mTEC1-雷帕霉素組作為mTOR及其下游被抑制的陽性對(duì)照。

蛋白行SDS-PAGE，70 V 2 h；350 mA轉(zhuǎn)膜2 h；PVDF膜洗滌后用5% BSA封閉1 h；抗Raptor、mTOR、p-mTOR、p70S6k、p-p70S6k和內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白等一抗按說明書用封閉液按1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；加入HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體（TBST稀釋，均為1∶10 000），室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；采用ECL檢測(cè)試劑盒曝光檢測(cè)各蛋白表達(dá)情況并進(jìn)行灰度掃描，使用Graph-Pad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.11 連續(xù)計(jì)數(shù)法檢測(cè)mTEC1-shRNA-Raptor細(xì)胞的增殖

將野生型mTEC1與穩(wěn)定感染shRNA-Raptor病毒的mTEC1以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的初始密度接種于12孔板，各接種7個(gè)復(fù)孔。每天各計(jì)數(shù)兩種細(xì)胞其中一個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)7 d；重復(fù)3次。

1.12 TUNEL法檢測(cè)mTEC1-shRNA-Raptor細(xì)胞的凋亡

將野生型mTEC1與穩(wěn)定感染shRNA-Raptor病毒的mTEC1以5 000個(gè)／孔接種于96孔板，5% CO237℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)羅氏公司Tunel試劑盒說明書染色。主要步驟如下：棄去96孔板中培養(yǎng)基，PBS洗2次；每孔加100μL 4%低聚甲醛（pH＝7.4），室溫固定20 min；PBS洗2次；加入新鮮配制的滲透液100μL置于冰上破膜10 min；PBS洗滌2次；將標(biāo)記溶液與酶濃縮液以9∶1比例混合，每孔加入50 μL，37℃孵育1 h；PBS洗滌2次，滴加1滴PBS置于熒光顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞可見綠色熒光。最后計(jì)算出陽性細(xì)胞比例。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05判斷差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 載體質(zhì)粒pLKO.1-puro酶切和電泳鑒定

pLKO.1-puro慢病毒載體經(jīng)酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示在1 900 bp和7 000 bp左右處出現(xiàn)條帶，表明載體質(zhì)粒酶切成功。見圖1。

2.2 Raptor shRNA目的片段與載體連接產(chǎn)物的鑒定

測(cè)序結(jié)果與插入的Raptor基因的shRNA序列5′-CCGGGCCCGAGTCTGTGAATGTAAT-CTCGAGATTACATTCACAGACTCGGGCTTTTTG-3′完全一致（第261～318位），表明成功構(gòu)建pLKO.1-puro-shRNARaptor載體。見圖2。

2.3 pLKO.1-puro-shRNA-Raptor穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mTEC1細(xì)胞系的建立

由圖3可見，與mTEC1組相比，shRNA-Raptor組Raptor蛋白、p-mTOR以及p-p70S6k表達(dá)量均明顯降低（P均＜0.05）；與mTEC1組相比，mTEC1-雷帕霉素組p-mTOR以及p-p70S6k表達(dá)量也明顯降低，但二者間Raptor蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此進(jìn)一步說明，shRNA-Raptor組pmTOR以及p-p70S6k表達(dá)降低是由Raptor基因抑制造成的。

圖1 p LKO.1-puro載體酶切電泳鑒定

圖2 pLKO.1-puro-shRNA-Raptor載體鑒定

圖3 免疫印跡檢測(cè)各組細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.4 mTEC1-shRNA-Raptor和野生型mTEC1細(xì)胞數(shù)變化

如圖4所示，mTEC1-shRNA-Raptor和mTEC1培養(yǎng)7 d，2種細(xì)胞同一天的細(xì)胞數(shù)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

圖4 mTEC1-shRNA-Raptor和mTEC1細(xì)胞計(jì)數(shù)

2.5 Tunel細(xì)胞凋亡試驗(yàn)陽性率統(tǒng)計(jì)

如圖5所示，mTEC1-shRNA-Raptor和野生型mTEC1細(xì)胞Tunel試驗(yàn)陽性率均很低，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝1.27，P＞0.05），表明2種細(xì)胞正常培養(yǎng)時(shí)很少發(fā)生凋亡。由此說明，Raptor基因敲降并不引起mTEC1明顯的凋亡。

3 討論

圖5 mTEC1與mTEC1-shRNA-Raptor細(xì)胞Tunel試驗(yàn)陽性率比較

自噬是細(xì)胞清除其損傷的細(xì)胞器或錯(cuò)誤折疊蛋白的重要方式。自噬減弱時(shí)，細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白堆積，導(dǎo)致細(xì)胞衰老死亡。mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路，其可抑制自噬［4］。大量文獻(xiàn)報(bào)道，mTOR活化增加可致細(xì)胞衰老和退化［5-9］。胸腺是機(jī)體最重要的中樞免疫器官，TECs是胸腺中最為重要的基質(zhì)細(xì)胞之一，是胸腺微環(huán)境的重要組成部分。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠年齡的增長，胸腺mTOR表達(dá)上調(diào)（未發(fā)表）。為進(jìn)一步研究mTOR在TECs退化中的作用，本研究通過建立mTORC1與下游作用的重要分子Raptor基因穩(wěn)定敲降的mTEC1細(xì)胞，成功構(gòu)建Raptor基因的pLKO.1-puro-shRNA慢病毒質(zhì)粒，并成功感染mTEC1。免疫印跡結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的mTEC1-shRNA-Raptor細(xì)胞Raptor和p-mTOR以及p-p70S6k蛋白表達(dá)水平明顯降低，說明已成功構(gòu)建Raptor基因敲降的mTEC1細(xì)胞系。mTOR參與細(xì)胞的增殖和凋亡，本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)計(jì)數(shù)法以及Tunel法檢測(cè)細(xì)胞增殖與凋亡，結(jié)果顯示，Raptor基因的敲降并不影響mTEC1增殖和凋亡。Foxn1是轉(zhuǎn)錄叉頭因子家族成員，在胸腺發(fā)育中起重要作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，敲除mTORC1／Raptor并不會(huì)引起胸腺的明顯萎縮和胸腺細(xì)胞的凋亡，只有聯(lián)合敲除Foxn1后，胸腺才發(fā)生明顯的退化和萎縮［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明這一點(diǎn)。盡管mTORC1信號(hào)通路參與細(xì)胞的生長增殖，但其對(duì)mTEC1的作用還未闡明，在胸腺退化過程中mTOR信號(hào)和Foxn1之間以何種方式發(fā)揮作用，尚有待深入研究。