向森，焉然，張開芳

1駐馬店市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南駐馬店463000

2黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，鄭州450006

早期胃癌（early gastric cancer，EGC）是指腫瘤浸潤深度在黏膜及黏膜下層者，其預(yù)后與胃癌分期密切相關(guān)，早期發(fā)現(xiàn)可改善患者預(yù)后[1]。然而，約5%的EGC患者術(shù)后會發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[2]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）是逃過免疫監(jiān)視，自腫瘤原發(fā)部位經(jīng)淋巴管或直接進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[3]。研究發(fā)現(xiàn)，包括EGC在內(nèi)的多種腫瘤早期即有CTC侵入外周血[4]。由于胃癌高發(fā)人群對該病的重視程度不夠，加之使用胃鏡大規(guī)模篩查EGC具有耗時長、難度大、費用高等缺點，中國胃癌的早期發(fā)現(xiàn)率遠(yuǎn)低于日本[5]。2012年，美國Cell Search檢測系統(tǒng)經(jīng)原國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)在中國上市，使便捷、無創(chuàng)地早期診斷EGC成為可能[6]。本研究旨在探討CTC對EGC的診斷和預(yù)后評估價值，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2014年1月至2015年6月于駐馬店市中心醫(yī)院經(jīng)胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)胃黏膜病變、疑似EGC的189例患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)胃黏膜病變，疑似EGC；②系首次診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷為進(jìn)展期胃癌者，即胃癌浸潤深度超過黏膜下層；②具有其他腫瘤病史的患者。經(jīng)病理診斷，189例患者中，64例為EGC患者，125例為非EGC患者（胃潰瘍89例，慢性胃炎36例）。EGC患者中，男44例，女20例；年齡為32～68歲，中位年齡為56歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 CTC檢測方法

Cell Search系統(tǒng)及其配套試劑均購自美國強(qiáng)生公司?？崭共杉颊哽o脈血7.5 ml，置于儲存管（Cell Save管）中，為減少上皮細(xì)胞的干擾，須在血常規(guī)或生化檢查血樣采集之后采集，采集后立即送檢。將儲存管中的血樣全部倒入預(yù)處理管（Cell Tracks Auto Prep錐形管）內(nèi)，管內(nèi)含有磁珠標(biāo)記的上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗體，再加入6.5 ml枸櫞酸鈉緩沖液，輕柔地顛倒混勻，2000 r/min離心10 min后即可上機(jī)檢測。Cell Search系統(tǒng)可利用磁場富集和固定Ep-CAM+細(xì)胞。依次加入藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的抗CK81和CK9抗體，異藻藍(lán)蛋白（allphycocyanin，APC）標(biāo)記的抗CD45抗體，最后加入4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），避光孵育20 min使細(xì)胞核著色。染色完畢后，使用Analyzer系統(tǒng)進(jìn)行熒光掃描，系統(tǒng)自動選取符合腫瘤細(xì)胞形態(tài)且有紅色標(biāo)記（CK+）的細(xì)胞進(jìn)行人工判讀，CK+DAPI+CD45-的細(xì)胞即為CTC陽性。

1.3 診斷、治療及隨訪

EGC的診斷和治療參考2013年版《NCCN胃癌臨床實踐指南》[7]。所有EGC患者均行腹腔鏡下胃大部切除術(shù)和淋巴結(jié)清掃術(shù)，再根據(jù)患者情況決定是否行輔助化療。采取電話、門診等方式進(jìn)行隨訪，所有患者均隨訪3年，隨訪截止時間為2018年6月。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均為計數(shù)資料。四格表資料的比較采用Pearson χ2檢驗、連續(xù)性校正法或Fisher確切概率法；當(dāng)20%以上單元理論頻數(shù)值小于5時，3×2列聯(lián)表的比較采用似然比χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC檢測結(jié)果與病理診斷結(jié)果的對照

189例患者中，24例患者的CTC呈陽性，均為EGC患者。CTC診斷EGC的靈敏度為37.50%（24/64），特異度為100%（125/125），陽性預(yù)測值為100%（24/24），陰性預(yù)測值75.76%（125/165），準(zhǔn)確率為78.84%（149/189）。（表1）

2.2 不同臨床特征EGC患者CTC表達(dá)情況的比較

表1 CTC檢測結(jié)果與病理診斷結(jié)果的對照

CTC陽性與CTC陰性EGC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、脈管癌栓情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；CTC陽性與CTC陰性EGC患者的性別、年齡、腫瘤位置、浸潤深度、分化程度和大體病理類型比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

2.3 不同臨床特征EGC患者預(yù)后的比較

表2 不同臨床特征EGC患者CTC表達(dá)情況的比較

隨訪3年，所有患者均生存，無死亡病例，其中5例患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，59例患者未復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。不同性別、年齡、腫瘤位置、浸潤深度、分化程度和大體病理類型的EGC患者的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；CTC陽性、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有脈管癌栓的EGC患者的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率均高于CTC陰性、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無脈管癌栓的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征EGC患者預(yù)后的比較

3 討論

1869年，Ashworth[8]首次在腫瘤患者血液中檢測到一種與腫瘤細(xì)胞相似的細(xì)胞，并首次提出了CTC學(xué)說。隨著近年來CTC檢測技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的腫瘤早期血行轉(zhuǎn)移證據(jù)被發(fā)現(xiàn)，而CTC被認(rèn)為是EGC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的直接原因[9]。Joosse等[10]研究認(rèn)為，CTC可檢出直徑1 mm的腫瘤，而一般影像學(xué)檢查只能檢出直徑10 mm左右的腫瘤。雖然胃鏡對胃癌的檢出率較高，但也可由于操作者熟練程度不佳、病灶微小取材不準(zhǔn)等原因?qū)е抡`診[11]。因此，CTC成為了胃癌早期診斷的一個研究方向。

既往報道多將各期胃癌作為整體研究，對所有分期的胃癌進(jìn)行CTC檢測，檢查CK和EpCAM，檢測方法包括免疫學(xué)方法和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）[12]，其靈敏度為 25%～82%[13-14]。本研究采用Cell Search系統(tǒng)檢測EGC患者的CTC表達(dá)情況，結(jié)果顯示，64例EGC患者中，僅24例患者CTC呈陽性，125例非EGC患者的CTC均呈陰性，靈敏度為37.50%，特異度為100%，陽性預(yù)測值為100%，陰性預(yù)測值為75.76%，準(zhǔn)確率為78.84%。說明Cell Search系統(tǒng)對EGC的診斷效能顯著低于胃鏡活檢，不適合作為診斷EGC的主要手段，與王振丹[15]的研究結(jié)果類似。有研究指出，發(fā)生血行轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞多已發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，其細(xì)胞表面不再表達(dá)或下調(diào)表達(dá)黏蛋白抗原，因此Cell Search系統(tǒng)利用EpCAM抗體進(jìn)行CTC富集是有缺陷的[16]。近年來，CTC檢測技術(shù)不斷發(fā)展，多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測有助于提高EGC的診斷效能[17]。Cyttel?-CTC檢測技術(shù)的診斷效能較高，使用范圍較廣，其通過陰性富集法去除血液中99.99%以上的白細(xì)胞，基本保證了血液CTC無損地富集，腫瘤細(xì)胞在表面抗原、核染色體及形態(tài)等方面的變化對檢測無干擾[18]。

黃寶俊等[19]對629例EGC患者進(jìn)行長期隨訪，結(jié)果顯示，31例（4.9%）患者因腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡，其中血行轉(zhuǎn)移占54.8%，最常見于肝臟和腦轉(zhuǎn)移，且多發(fā)生在術(shù)后3年內(nèi)。Msaouel和Koutsilieris[20]的研究認(rèn)為，多數(shù)CTC會因機(jī)體免疫或環(huán)境不適應(yīng)而凋亡，僅少數(shù)具有器官親嗜性或活力較強(qiáng)的細(xì)胞可以存活下來，經(jīng)血液或淋巴結(jié)實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究中，術(shù)后3年發(fā)生肝轉(zhuǎn)移4例，復(fù)發(fā)1例，與上述研究結(jié)果一致。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌最常見的轉(zhuǎn)移途徑，本研究分析了不同臨床特征EGC患者的CTC表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓患者的CTC均為陽性；CTC陽性與CTC陰性EGC患者的性別、年齡、腫瘤位置、浸潤深度、分化程度和大體病理類型比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示EGC患者的CTC可能來源于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。既往研究報道，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓均是EGC預(yù)后不良的獨立危險因素[21]，與本研究結(jié)果類似。本研究中，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的5例患者均為CTC陽性，提示CTC可作為EGC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的輔助檢查手段，并可能作為預(yù)后不良的獨立預(yù)測因素，與Brungs等[22]的研究結(jié)果類似。當(dāng)CTC陽性時，EGC患者預(yù)后不良的可能性較大，采取與高?；颊呦嗤幕煼桨缚赡軙够颊攉@益。

綜上所述，應(yīng)用Cell Search系統(tǒng)檢測CTC對EGC的診斷效能較低，但可作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良的參考指標(biāo)。