李會(huì)政，劉琳，崔玲，張穎，劉雙，王玲

大連市友誼醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，遼寧 大連116100

喉癌的發(fā)病率在頭頸部惡性腫瘤中居第2位[1]，尤其在中國北方地區(qū)高發(fā)。罹患喉癌后，患者呼吸、發(fā)聲、吞咽等重要生理功能受損，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降[2-3]。喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制一直是該病防治研究的關(guān)鍵。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）屬于一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的RNA分子，雖然不具有編碼蛋白質(zhì)的潛能，但可在基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，如參與多種生物學(xué)過程和信號(hào)通路的調(diào)控等[4-7]。近期的研究結(jié)果表明，lncRNA與喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8-11]。有學(xué)者利用芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MAGI2反義鏈RNA3（MAGI2-antisense strand 3，MAGI2-AS3）在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)[12-13]，提示其可能是喉鱗狀細(xì)胞癌中異常下調(diào)的抑癌基因。然而，MAGI2-AS3在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系以及其細(xì)胞生物學(xué)功能尚不明確。

本研究檢測(cè)了喉鱗狀細(xì)胞癌組織及配對(duì)喉正常黏膜組織MAGI2-AS3的表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析MAGI2-AS3表達(dá)水平與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床分期、病理類型、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床特征的關(guān)系，并在體外喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中過表達(dá)MAGI2-AS3后觀察細(xì)胞遷移、侵襲惡性表型的變化以及上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）標(biāo)志物的改變，明確MAGI2-AS3在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過程中的潛在生物學(xué)功能。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年1月至2015年12月大連市友誼醫(yī)院初診為喉鱗狀細(xì)胞癌患者80例?；颊呷朐呵拔葱蟹呕熂吧镏委煟?jīng)B超、計(jì)算機(jī)體層攝影（CT）等檢查排除其他部位原發(fā)腫瘤；無乙肝等感染病病史及家族遺傳性疾病病史。腫瘤組織均經(jīng)過病理檢查確診為喉鱗狀細(xì)胞癌。80例患者中，男73例，女7例；年齡為39～78歲，中位年齡為60.8歲；有吸煙史77例，無吸煙史3例；臨床分型：聲門上型36例，聲門型38例，聲門下型6例；病理類型：高、中分化鱗癌62例，低分化鱗癌18例；臨床分期：T1期23例，T2期23例，T3期26例，T4期8例；有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例，無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例。選取患者的腫瘤組織及相應(yīng)癌旁正常黏膜組織用于后續(xù)試驗(yàn)。本研究經(jīng)大連市友誼醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)備案。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol試劑為美國賽默飛世爾公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis和SYBR Green法定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative-PCR，qRT-PCR）引物由華大基因科技有限公司合成。7500 Fast型qRT-PCR儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)（Applied Biosystems）公司產(chǎn)品。

1.3 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

組織總RNA用Trizol試劑提取后，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及純度合格后凍存?zhèn)溆?。cDNA合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μl：2×RT Mix10 μl，HiScript?Ⅱ Enzyme Mix 2 μl，隨機(jī)引物1 μl，1 μg總RNA，加無RNA酶去離子水至20 μl。反應(yīng)條件為25℃下5 min，50℃下45 min，85℃下5 min。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)MAGI 2-AS 3的相對(duì)表達(dá)量

U6基因?yàn)閮?nèi)參，7500 Fast型qRT-PCR儀檢測(cè)MAGI2-AS3基因CT值，反應(yīng)體系為20 μl，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。qRT-PCR反應(yīng)條件為95℃下30 s，95℃下10 s,60℃下30 s，以上反應(yīng)設(shè)置為40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)置如下反應(yīng)條件，建立PCR產(chǎn)物溶解曲線：95℃下15 s；60℃下60 s；60℃開始，每個(gè)循環(huán)增加0.5℃，直至95℃，最后95℃下反應(yīng)15 s。MAGI2-AS3定量PCR引物，F(xiàn)：5'-GATGTAGCAAGAGTTGGGAAGA-3'，R：5'-CATGTATTATCGCAGTGGGTTTG-3'。內(nèi)參基因U6定量PCR引物，U6-F：5'-TCGCTTCGGCAGCACATAT-3'，U6-R：5'-ATTTGCGTGTCATCCTTGC-3'。采用 2-△△Ct法計(jì)算MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量，其中△△Ct=腫瘤組織（Ct MAGI2-AS3-CtU6）-癌旁正常黏膜組織（Ct MAGI2-AS3-CtU6）。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5 MAGI 2-AS 3過表達(dá)載體的建立

以喉鱗狀細(xì)胞癌組織cDNA為模板，使用引物MAGI2-AS3-F-NheⅠ ：5'-GCTGGCTAGCATTGCCCTGCGCCCCGAGCGGT-3'和MAGI2-AS3-RXhoⅠ：5'-CGGCCTCGAGGAGAAAATAACAGGATTCATCTCCPCR-3'擴(kuò)增獲得MAGI2-AS3全長(zhǎng)序列，亞克隆至pcDNA3.1陽性載體NheⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)之間，獲得MAGI2-AS3過表達(dá)載體，載體經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證正確。

1.6 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力

選取本科實(shí)驗(yàn)室存儲(chǔ)的喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2。培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）加入10%胎牛血清（以色列BI公司）。Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)MAGI2-AS3載體和空白載體，轉(zhuǎn)染后第2天，計(jì)數(shù) 1×105個(gè)細(xì)胞，用 100 μl無血清 DMEM-F12、MEM培養(yǎng)基重懸，加入Transwell小室上室，下室加入約600 μl完全培養(yǎng)基。37℃下5%CO2孵育48 h后取出小室，棉簽擦去上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌1次，結(jié)晶紫染色10 min后PBS浸洗，拍照后用醋酸洗滌小室，光密度（optical density，OD）450測(cè)吸光度。侵襲實(shí)驗(yàn)在Transwell小室上室平鋪Martrigel膠，其余操作與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.7 蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting）法檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量

空載Hep-2細(xì)胞和過表達(dá)MAGI2-AS3后的Hep-2細(xì)胞用放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司）裂解提取總蛋白，按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司）說明書檢測(cè)各樣品蛋白濃度，校正上樣量；沸水浴加熱3～5 min，使蛋白變性，負(fù)載緩沖液（loading buffer）混勻后上樣于預(yù)制膠（上海翊圣生物科技有限公司），100 V電泳2 h，轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，4℃一抗過夜搖床孵育，二抗孵育 2 h，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液（美國Advansta公司）浸透后用成像儀檢測(cè)并獲取圖像。其中，一抗上皮鈣黏素（E-cadherin）、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）、snail、波形蛋白（vimentin）、內(nèi)參蛋白GAPDH均購自美國CST公司。

1.8 生物信息學(xué)公共數(shù)據(jù)庫

MAGI2-AS3在頭頸部鱗癌中相對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫，相應(yīng)分析圖表生成于GEPIA軟件。MAGI2-AS3表達(dá)中位值是根據(jù)GEPIA系統(tǒng)中TCGA測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)計(jì)算得出。MAGI2-AS3表達(dá)量在中位值以上定義為高表達(dá)，中位值以下定義為低表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法，由GEPIA軟件自動(dòng)生成。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MAGI 2-AS 3在喉鱗狀細(xì)胞癌組織及正常組織中的表達(dá)情況

在檢測(cè)的80例喉鱗狀細(xì)胞癌和相應(yīng)癌旁正常黏膜組織中，63例喉鱗狀細(xì)胞癌組織的MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常黏膜組織，17例喉鱗癌組織的MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常黏膜組織。比較整體MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，癌旁正常黏膜組織的MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量是喉鱗狀細(xì)胞癌組織的（1.504±0.145）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.275，P＜0.01）（圖1）。

2.2 不同臨床特征喉鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤組織中MAGI 2--AS3的表達(dá)情況

圖1 喉鱗狀細(xì)胞癌組織（n=80）與癌旁正常黏膜組織（n=80）中MAGI 2-AS 3的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)

依據(jù)2-△△Ct方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量后結(jié)合患者的臨床特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：不同性別、年齡、臨床分期、分化程度及吸煙情況患者的MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但T3+T4期、有淋巴轉(zhuǎn)移患者的MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量分別為（0.419±0.253）、（0.303±0.119），均低于T1+T2期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的（0.823±0.203）、（0.767±0.339），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.975、2.100，P＜0.05）。（表1）

2.3 過表達(dá)MAGI 2-AS 3對(duì)Hep- 2細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

表1 不同臨床特征的喉鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤組織中MAGI 2-AS 3的相對(duì)表達(dá)量（n=80）

Hep-2細(xì)胞過表達(dá)MAGI2-AS3后的遷移能力是空載Hep-2細(xì)胞的（0.403±0.181）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.271，P＜0.01）；Hep-2細(xì)胞過表達(dá)MAGI2-AS3后的侵襲能力是空載Hep-2細(xì)胞的（0.502±0.090）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=77.699，P＜0.01）。（圖2）

2.4 過表達(dá)MAGI 2-AS 3對(duì)Hep- 2細(xì)胞蛋白表達(dá)的

圖2 Transwell小室檢測(cè)空載Hep- 2細(xì)胞（vector）及過表達(dá)MAGI 2-AS 3后Hep- 2細(xì)胞（OE-MAGI 2-AS 3）的遷移、侵襲能力對(duì)比（結(jié)晶紫染色，×100）

喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2過表達(dá)MAGI2-AS3后，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平高于空載Hep-2細(xì)胞，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、snail、vimentin表達(dá)水平低于空載Hep-2細(xì)胞。（圖3）

2.5 MAGI 2--AS3在頭頸部鱗癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平及與預(yù)后的關(guān)系

圖3 Western blotting法檢測(cè)過表達(dá)MAGI 2-AS 3的Hep- 2細(xì)胞的EMT標(biāo)志物表達(dá)情況

利用GEPIA軟件上的TCGA數(shù)據(jù)庫分析MAGI2-AS3在頭頸部鱗癌組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，在519例頭頸部鱗癌組織中MAGI2-AS3的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平低于44例正常癌旁黏膜組織（P＜0.05）。519例頭頸部鱗癌組織中有隨訪生存信息的患者516例，利用GEPIA軟件中的生存模塊分析顯示，MAGI2-AS3高表達(dá)患者的中位生存時(shí)間長(zhǎng)于低表達(dá)患者，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖4）

圖4 TCGA數(shù)據(jù)庫中頭頸部鱗癌（HNSCC）（n=519）、癌旁正常黏膜（normal）（n=44）中MAGI 2-AS 3相對(duì)表達(dá)量以及K-M生存曲線（n=516）

3 討論

lncRNA以往被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的垃圾產(chǎn)物或噪音，但研究表明其具有重要的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控功能，如在轉(zhuǎn)錄沉默、轉(zhuǎn)錄激活、染色體修飾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^程中都發(fā)揮著重要的作用[12]。特別是在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色，是目前腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。MAGI2-AS3由人基因組7號(hào)染色體79452957-79471208區(qū)域的DNA序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。Zhang等[13]利用基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MAGI2-AS3在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織。然而，MAGI2-AS3在喉鱗狀細(xì)胞癌中的功能和作用機(jī)制尚不明確。本研究采用qRTPCR技術(shù)對(duì)80例喉鱗狀細(xì)胞癌組織及相應(yīng)癌旁正常黏膜組織中的MAGI2-AS3表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常黏膜組織，提示MAGI2-AS3表達(dá)量降低與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究利用GEPIA軟件上的TCGA數(shù)據(jù)庫分析MAGI2-AS3在頭頸部鱗癌組織中相對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其在519例頭頸部鱗癌組織中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平低于44例正常癌旁黏膜組織（P＜0.05），這與本研究的檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致。

臨床分期、病理類型及是否發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是喉鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后評(píng)估的重要臨床指標(biāo)[14-17]。本研究發(fā)現(xiàn)聲門上型、聲門型和聲門下型喉鱗狀細(xì)胞癌患者的MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在組織學(xué)分化程度中，低分化喉鱗狀細(xì)胞癌患者與高、中分化喉鱗狀細(xì)胞癌患者的MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，不同年齡及是否有吸煙史的患者M(jìn)AGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。值得注意的是：T3+T4期、有淋巴轉(zhuǎn)移患者的MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量均低于T1+T2期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）。腫瘤中表達(dá)下調(diào)的基因常被認(rèn)為可能是重要的抑癌基因[18-20]，因此，可以推測(cè)MAGI2-AS3在喉鱗狀細(xì)胞癌中可能通過調(diào)控下游蛋白編碼基因水平抑制喉鱗狀細(xì)胞癌惡性表型。本研究在喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2進(jìn)一步過表達(dá)MAGI2-AS3后發(fā)現(xiàn)，Hep-2細(xì)胞的遷移能力及侵襲能力均受到抑制（P＜0.01）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MAGI2-AS3后，可明顯改變Hep-2 EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平。上述結(jié)果表明MAGI2-AS3可能通過介導(dǎo)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)發(fā)揮對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控，但具體調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步明確。

TCGA公共數(shù)據(jù)庫中頭頸部鱗癌中有隨訪生存信息的患者516例，利用GEPIA軟件中的生存模塊分析發(fā)現(xiàn)，MAGI2-AS3高表達(dá)患者的中位生存時(shí)間略長(zhǎng)于低表達(dá)患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

綜上所述，本研究結(jié)果初步證實(shí)喉鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量降低，且T3+T4期、有淋巴轉(zhuǎn)移患者的MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量均低于T1+T2期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。在未來的研究中進(jìn)一步明確MAGI2-AS3在喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制，對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的理解及未來的分子靶向治療具有重要的意義。