李浩蘭，李桐，李文忠，路國秋，王建東

1北京中捭生物科技有限公司，北京100080

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京100010

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是致死率最高的婦科惡性腫瘤，由于發(fā)病隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，約70%的患者在就診時已屬于晚期[1]，經(jīng)過手術(shù)以及化療后仍有超過80%的患者會復(fù)發(fā)[2]。尋找新的OC治療方法對于提高患者的生存率具有重要意義。嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）治療技術(shù)是新型的抗腫瘤免疫療法，在血液腫瘤治療中取得了很好的效果，但在OC中應(yīng)用較少，其治療效果和OC的抗原靶點有關(guān)。本文回顧和總結(jié)CAR-T技術(shù)以及卵巢中可應(yīng)用于CAR-T治療的不同類型的靶點抗原，旨在為卵巢癌CAR-T治療的靶點選擇提供理論支持。

1 CAR-T技術(shù)

CAR-T是一種經(jīng)過基因修飾來靶向腫瘤特異性抗原的自體T細(xì)胞療法，現(xiàn)已經(jīng)開發(fā)到第四代[3]。第一代嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）結(jié)構(gòu)在2006年首次被構(gòu)建，其包含細(xì)胞外識別腫瘤抗原的單鏈可變區(qū)（single-chain variable fragment，scFv），促進CAR和與靶細(xì)胞表面膜近側(cè)抗原結(jié)合的鉸鏈區(qū)以及細(xì)胞內(nèi)的免疫細(xì)胞活化序列CD3ζ。第一代CAR-T在OC的Ⅰ期臨床試驗中并未顯示出明顯的抗腫瘤作用[4]，故研究者開始對CAR的結(jié)構(gòu)進行改造以增強CAR-T的抗腫瘤作用。第二代CAR在第一代的基礎(chǔ)上增加了一個細(xì)胞內(nèi)共刺激信號元件，如 CD28、CD134、CD137或 CD27[5]。共刺激信號元件的加入顯著延長了CAR-T在體內(nèi)的存活時間并增強了其抗腫瘤作用，首次用于B細(xì)胞淋巴瘤治療也展示出了良好的抗腫瘤效果[6]。第三代CAR則包含兩個及以上的共刺激信號元件，旨在提高轉(zhuǎn)基因的表達，促進CAR-T的激活和擴增，在體內(nèi)試驗中包含CD28和CD137兩個共刺激元件的第三代CAR-T顯示出更強的抗腫瘤活性[7]。第四代CAR則加入了細(xì)胞因子來增強CART殺傷腫瘤細(xì)胞的效果[8]。經(jīng)過十多年的發(fā)展，CAR結(jié)構(gòu)基本明確：包含細(xì)胞外特異性識別腫瘤抗原的scFv片段、促進與腫瘤表面膜近側(cè)抗原結(jié)合的鉸鏈區(qū)、固定CAR的跨膜區(qū)、增強T細(xì)胞活化的共刺激元件和T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)CD3ζ鏈[9]。當(dāng)靶細(xì)胞上的抗原與CAR上的受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合時，通過鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)將信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)信號域?qū)⑿盘栟D(zhuǎn)化為活化信號，激活效應(yīng)細(xì)胞進行增殖，產(chǎn)生細(xì)胞因子和穿孔素等殺傷靶細(xì)胞[10]。目前多采用第二代（單共刺激信號元件）和第三代（雙共刺激信號元件）CAR進行臨床試驗。（圖1）

圖1 四代CAR的結(jié)構(gòu)示意圖

CAR-T療法已經(jīng)在血液腫瘤治療中取得了突破性成就。第一個靶向CD19的CAR-T藥物CTL019用于治療兒童及年輕成人復(fù)發(fā)性/難治性急性淋巴細(xì)胞白血病，3個月完全緩解率可達83%[11]，并于2017年8月獲得美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)上市。此外，另一藥物YESCARTA在治療大B細(xì)胞淋巴瘤時完全緩解率可達51%[12]，并最終于2017年10月獲得FDA批準(zhǔn)上市，成為首款針對特定非霍奇金淋巴瘤的CAR-T治療藥物。CAR-T在實體瘤的治療中也展現(xiàn)出了巨大的潛力。2016年12月，希望之城（Hope of City）研究中心利用靶向白細(xì)胞介素-3 受體 α2（interleukin-3 receptor α2，IL-3Rα2）的CAR-T治療復(fù)發(fā)性多灶膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，10次腦室注射治療后，患者腫瘤病灶完全消失且未出現(xiàn)強烈的不良反應(yīng)[13]。2017年7月賓夕法尼亞大學(xué)關(guān)于靶向表皮生長因子受體Ⅲ型突變體（epidermal growth factor receptor variantⅢ，EGFRVⅢ）陽性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的CAR-TⅠ期臨床試驗結(jié)果表明，CAR-T能夠成功穿越血腦屏障，在腫瘤位點發(fā)現(xiàn)了CAR-T的浸潤[14]。此外，針對肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等腫瘤均已開展靶向特異性腫瘤抗原的CAR-T療法[15-17]。

2 CAR- T治療OC的抗原靶點

目前CAR-T療法面臨的主要挑戰(zhàn)是臨床安全性，因此選擇合適的靶點對于CAR-T療法的安全性和有效性至關(guān)重要。理想的腫瘤靶點應(yīng)該在惡性腫瘤組織中表達而在正常組織中不表達，因為即使在正常組織中只有低劑量的表達也會導(dǎo)致急性和嚴(yán)重的脫靶毒性[18-20]。目前國內(nèi)針對OC的CAR-T治療的研究很少，但國際上一些著名研究機構(gòu)如紀(jì)念斯隆凱瑟琳癌癥中心（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，MSKCC）和賓夕法尼亞大學(xué)等已經(jīng)開展了關(guān)于OC的CAR-T治療研究（表1）[1,4,15,21-27]。

2.1 人表皮生長因子受體（human epithelial growth factor receptor 2，HER 2）

HER2為人表皮生長因子受體家族的成員之一，是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體樣蛋白，分子量為185 kD，由與配體結(jié)合的胞外區(qū)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜區(qū)和具有激酶活性的胞內(nèi)區(qū)組成[1]。HER2能夠抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)新生血管生成，提高細(xì)胞運動能力從而促進腫瘤的生長增殖和浸潤轉(zhuǎn)移[28]。HER2在正常組織如胃腸道、呼吸道、尿道、皮膚、乳腺和胎盤中均有不同程度的表達[29]。研究表明，在2%～66%的OC組織中能夠檢測到HER2的過表達[30]，因此HER2可作為OC CAR-T治療中的特異性靶點。晚期OC患者通常高表達HER2，并且患者體內(nèi)可以檢測到CD4+和CD8+T細(xì)胞的響應(yīng)[31]。目前針對OC的CAR-T研究已完成臨床前體外實驗，可證明HER2-CAR-T能夠識別并殺傷表達HER2的OC細(xì)胞，而對HER2表達陰性的細(xì)胞不產(chǎn)生響應(yīng)[32]，現(xiàn)已有兩項Ⅰ期臨床試驗正在進行中。

2.2 間皮素（mesothelin，MSLN ）

MSLN是一種糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定蛋白，分子量為69 kD，蛋白酶加工后形成一個40 kD的膜結(jié)合蛋白和一個31 kD稱之為巨核細(xì)胞促進因子的脫落片段并釋放至細(xì)胞外[33]。MSLN能夠通過影響絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡，同時還參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路來影響細(xì)胞的增殖，進而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[34]。MSLN一般限制性地表達于胸膜、腹膜、心包的漿膜細(xì)胞及氣管、卵巢、扁桃體、輸卵管的間皮細(xì)胞上。研究證明，MSLN表達于多種實體瘤中，其中約70%的OC組織中存在MSLN的表達[35]，因此MSLN可作為OC CAR-T治療的潛在靶點。臨床前實驗結(jié)果表明，人源化MSLN-CAR-T在體外與MSLN陽性細(xì)胞共培養(yǎng)時能夠產(chǎn)生炎性因子并有效裂解靶細(xì)胞，體內(nèi)回輸OC細(xì)胞移植小鼠模型表現(xiàn)出一定的抗腫瘤效應(yīng)[21]，同時并未出現(xiàn)脫靶毒性。目前已有兩個靶向MSLN的CAR-T臨床試驗分別在美國（已完成）和中國展開（正在招募中）。

表1 CAR-T療法靶向特異性腫瘤抗原治療OC的試驗總結(jié)

2.3 葉酸受體 α（folate receptor α，F(xiàn)R α）

FRα是由GPI錨定的一個38 kD的蛋白，介導(dǎo)葉酸的攝入、細(xì)胞增殖、氨基酸代謝、DNA和RNA的合成及甲基化等過程[30]。FRα在腎、胃、肺等正常組織的上皮細(xì)胞腔面上有微弱的表達，在多種腫瘤組織如OC、子宮內(nèi)膜癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌中過表達。其中超過90%的OC組織高表達FRα，表達水平比正常卵巢組織，高90倍[36]。此外，考慮到FRα的生物學(xué)功能，F(xiàn)Rα的CAR-T治療將會是相對安全和易耐受的，這使得FRα成為OC CAR-T治療的理想靶點。臨床前實驗結(jié)果證明，加入共刺激元件CD27的第二代FRα-CAR-T展示出了有效的裂解OC細(xì)胞的能力[4]。目前針對FRα-CAR-T治療的Ⅰ期臨床試驗已完成。

2.4 黏蛋白 16（mucin 16，MUC16）

MUC16是一種高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，由60個重復(fù)序列的156個氨基酸的胞外段、跨膜段和32個氨基酸的胞內(nèi)段組成。MUC16參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和增殖過程[37]。MUC16能夠抑制自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞的激活從而阻止NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，NK細(xì)胞也能夠與MSLN結(jié)合，提高細(xì)胞黏附性，同時MUC16還可以與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)JAK激酶2（Janus kinase 2，JAK2）結(jié)合上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）和胚胎干細(xì)胞多能性維持關(guān)鍵基因（Nanog homeobox，NANOG）的表達，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[38]。MUC16在正常組織中幾乎不表達，而在超過80%的OC細(xì)胞中高表達，另外在子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌細(xì)胞中也有過表達[39]。MUC16在腫瘤細(xì)胞中存在剪切機制，胞外段糖類抗原 125（carbohydrate antigen 125，CA125）經(jīng)剪切后被釋放，并可在血漿中被檢測到。CA125作為OC免疫標(biāo)志物檢測中的重要參考指標(biāo)，超過90%的OC患者血清中CA125的表達上調(diào)，而術(shù)后患者體內(nèi)CA125高表達者復(fù)發(fā)率高達85%～93%[40]。因此MUC16同樣可作為OC CAR-T治療的理想靶點。MSKCC針對MUC16開發(fā)的單靶點CAR-T在臨床前研究中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤效果，現(xiàn)正開展Ⅰ期臨床研究[22]。

2.5 紐約食管鱗狀細(xì)胞癌 1（New York esophageal 1，NY-ESO- 1）

NY-ESO-1屬于癌-睪丸抗原（cancer-testis antigen，CTA）家族，分子量為18 kD，N端含有甘氨酸富集區(qū)，C端為一個疏水氨基酸尾，NY-ESO-1的作用機制尚不清楚[41]。作為CTA，NY-ESO-1在正常組織中僅限制性地表達于睪丸和胚胎組織，但是在多種腫瘤組織，如OC、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤等中均有高表達[42]。此外，由于血睪屏障的存在，正常組織并不會發(fā)生免疫毒性，因此NY-ESO-1是OC CAR-T治療的理想靶點。研究發(fā)現(xiàn)，約43%的OC腫瘤組織中高表達NY-ESO-1，并且能夠?qū)YESO-1多肽發(fā)生響應(yīng)從而產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞[43]，并且這種CD8+T細(xì)胞能夠在71%的OC患者的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞和腫瘤相關(guān)淋巴細(xì)胞中檢測到[44]。目前針對NY-ESO-1的CAR-T治療在OC中未開展相關(guān)研究，但對于多發(fā)性骨髓瘤治療已完成臨床前階段，第二代NY-ESO-1-CAR-T細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中能夠釋放炎性因子并有效裂解靶細(xì)胞，同時也能夠發(fā)揮明顯的體內(nèi)抗腫瘤作用[23]。目前針對表達NY-ESO-1的OC的臨床試驗多采用T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）療法，且未見不良反應(yīng)[45]。這為NY-ESO-1的CAR-T治療的安全性奠定了基礎(chǔ)。

2.6 卵泡刺激激素受體（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）

FSHR是由寡聚糖蛋白構(gòu)成的七次跨膜受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，由695個氨基酸組成[46]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR能夠通過與卵泡刺激素結(jié)合來調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育，并在腫瘤血管形成中發(fā)揮作用[47]。FSHR僅在睪丸支持細(xì)胞和卵巢粒層細(xì)胞中表達，而在其他正常組織中不表達。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR在33%的透明細(xì)胞性O(shè)C、67%的黏液性O(shè)C和70%的子宮內(nèi)膜癌中均存在高表達[48]，因此，F(xiàn)SHR可作為OC CAR-T治療的潛在靶點。目前針對OC靶向FSHR的CAR-T治療已經(jīng)完成了臨床前試驗，結(jié)果顯示FSHR-CAR-T細(xì)胞能夠特異性殺傷表達FSHR的OC細(xì)胞，同時在體內(nèi)試驗時表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效果，顯著地提高小鼠的生存率，并且沒有觀察到不良反應(yīng)[24]。

2.7 其他抗原

除了上文提到的一些抗原，還有其他一些潛在靶點，如自然殺傷細(xì)胞2族成員D配體（natural killer group 2 member D ligand，NKG2DL）、CD133、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、腎母細(xì)胞瘤1（Wilms tumor 1，WT1）等，在OC中也呈現(xiàn)較高的表達水平。

NKG2DL廣泛表達于OC組織中[49]。目前針對OC的NKG2DL-CAR-T治療已經(jīng)完成臨床前試驗，NKG2DL-CAR-T細(xì)胞能夠有效殺傷表達NKG2DL的OC細(xì)胞[25]。Ⅰ期臨床試驗已經(jīng)展開。

CD133為一個干細(xì)胞標(biāo)志物抗原，在約31%的OC組織中有表達[50]。臨床前實驗中，CD133-CART細(xì)胞能夠有效發(fā)揮抑制OC移植瘤小鼠腫瘤生長的作用[26]，靶向CD133治療OC的CAR-T治療也已經(jīng)開展。

EGFR和HER2同屬于人表皮生長因子受體家族的成員，能夠促進腫瘤血管的生成。EGFR在35%～70%的OC中有表達[51]。臨床前試驗表明EFGRCAR-T細(xì)胞能夠有效殺傷表達EGFR的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[15]，針對高表達EGFR的OC的CAR-T臨床試驗也在進行中。

WT1能夠促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，在超過50%的OC和子宮內(nèi)膜癌中呈現(xiàn)高表達，且WT1高表達的腫瘤患者通常預(yù)后較差[30]。目前以WT1為靶點的OC治療已經(jīng)展開了TCR治療研究[27]，這為WT1的CAR-T治療奠定了基礎(chǔ)。

3 小結(jié)與展望

CAR-T療法經(jīng)過近幾年爆炸式的發(fā)展，已經(jīng)成功應(yīng)用于血液病以及部分實體腫瘤的治療，并與“免疫檢查點阻斷抗體療法”一起被評為“2013年度十大科學(xué)突破”之首[52]。目前針對OC的CAR-T療法在臨床前試驗和臨床試驗中均表現(xiàn)出較好的治療效果，但也存在著一些限制。首先，臨床上，CART回輸后可能引起包括脫靶效應(yīng)、細(xì)胞因子釋放綜合征、發(fā)熱反應(yīng)等不良反應(yīng)，因此選擇合適的靶點抗原能夠有效避免脫靶效應(yīng)，使CAR-T發(fā)揮最大作用。此外，由于高度異質(zhì)化的實體腫瘤不會均一地表達單一靶抗原，且單一靶點的CAR-T治療往往會誘發(fā)對應(yīng)靶抗原的丟失，使得單一靶點的CAR-T不能有效識別和殺傷腫瘤細(xì)胞，從而限制其治療效果。目前已有研究組織利用雙靶點技術(shù)同時靶向多個抗原[53-54]，這樣能夠有效避免抗原的逃逸，也提高了CAR-T治療的安全性。其次，腫瘤微環(huán)境中存在的免疫負(fù)調(diào)控機制會抑制腫瘤微環(huán)境內(nèi)T細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)，導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭，影響CAR-T的治療效果。目前已有多個研究組織和機構(gòu)將CART技術(shù)同免疫檢查點抑制劑聯(lián)用，一方面解除T細(xì)胞的免疫抑制狀態(tài)，一方面增強T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的攻擊力，從而對OC發(fā)揮更強的療效。

將CAR-T技術(shù)應(yīng)用到OC的治療中，并通過選擇合適的抗原、雙靶點技術(shù)和同免疫檢查點抑制劑聯(lián)用等方法解除CAR-T技術(shù)在OC臨床治療中的限制，不僅能夠豐富現(xiàn)有有限的治療手段，同時有望突破OC復(fù)發(fā)率高、效果不佳的困境，達到“根治”的效果，從而使更多的患者從中受益。