黃之鐠，何志明，張?chǎng)?，馬偉光，袁玉鮮，陳海豐，*

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南昆明650500；2.云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南昆明650000）

酸棗仁為棗屬植酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.Spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的種子[1]，是一種常用的藥食兩用物質(zhì)。具有養(yǎng)心安神、斂汗的功效，臨床常用于心悸失眠，體虛多汗等癥。研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁含有三萜及皂苷、黃酮類、生物堿、脂肪酸等化學(xué)成分，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗心律失常、鎮(zhèn)痛、抗驚厥等多種藥理活性，其中又以鎮(zhèn)靜催眠作用應(yīng)用最廣[2-3]。種子經(jīng)萌發(fā)處理，不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得以提高，化學(xué)成分、藥理活性也會(huì)發(fā)生改變，還會(huì)帶有口感與氣味的醇化[4]。酸棗仁皂苷A、B 及斯皮諾素作為酸棗仁的主要活性成分[5-8]，常用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定含量。為探究酸棗仁萌發(fā)對(duì)活性成分含量的影響，本文參考2015年版《中國(guó)藥典》中酸棗仁及其加工品的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用HPLC 測(cè)定不同萌發(fā)時(shí)間對(duì)酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B 及斯皮諾素含量的影響，為酸棗仁萌發(fā)中主要活性成分的變化提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000 高效液相色譜儀（包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、UV 檢測(cè)器、柱溫箱）：美國(guó)DIONEX 公司；SKF-6 超聲清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；GX-200 萬分之一分析天平：日本A&D；Millipore 超純水處理系統(tǒng)：美國(guó)Millipore 公司。

1.2 材料與試劑

酸棗仁皂苷A 對(duì)照品（批號(hào)AF8042003）、酸棗仁皂苷B 對(duì)照品（批號(hào)AF8042001）：成都埃法生物科技有限公司；斯皮諾素對(duì)照品（批號(hào)20170306）：上海莼試生物有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）：天津市康科德科技有限公司；水為超純水，其余所用試劑均為分析純；酸棗仁購(gòu)于藥材市場(chǎng)，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院張潔副教授鑒定為棗屬植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Huex H.F.Chou 的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 酸棗仁皂苷A、B 的色譜條件

色譜柱：Kromat Universil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～15 min，20 %A→40 %A；15 min ～28 min，40 %A；28 min～30 min，40 %A→70 %A；30 min～32 min，70 %A→100 %A）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm[1]。在上述條件下，酸棗仁中酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B 達(dá)到基線分離，樣品中的其他成分對(duì)分析無明顯干擾。結(jié)果見圖1。

2.1.2 斯皮諾素的色譜條件

色譜柱：Kromat Universil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：20 ℃；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～10 min，12 %A→19 %A；10 min～16 min，19 %A→20%A；16 min～22 min，20%A→100%A；22 min～30 min，100 %A）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：335 nm[1]。在上述條件下，酸棗仁中斯皮諾素達(dá)到基線分離，樣品中的其他成分對(duì)分析無明顯干擾。結(jié)果見圖2。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

2.2.1 酸棗仁皂苷A、B 混合對(duì)照品溶液

精密稱取酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B 各2.0 mg，置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得酸棗仁皂苷A、B 質(zhì)量濃度分別為0.2、0.2 mg/mL 的混合對(duì)照溶液，備用。臨使用前0.45 μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.2.2 斯皮諾素對(duì)照品溶液

精密稱取斯皮諾素2.0 mg，置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得斯皮諾素質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的對(duì)照溶液，備用。臨使用前0.45 μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.3 供試樣品的制備

分別取酸棗仁及萌發(fā)3、4、5、6、7、8、9、10 d 的芽品粉末（過四號(hào)篩）約l g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚適量，加熱回流4 h，棄去石油醚液，酸棗仁渣晾曬揮去溶劑，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，加入70%乙醇20 mL，加熱回流2 h，過濾，濾渣用70%乙醇5 mL 洗滌，合并洗液與濾液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得酸棗仁皂苷A、B 測(cè)定供試液。取上述供試液1mL 置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得斯皮諾素測(cè)定供試液。測(cè)定時(shí)用0.45 μm 的微孔濾膜過濾。

2.4 線性關(guān)系的考察

分別精密量取酸棗仁皂苷A、B 混合對(duì)照品溶液、斯皮諾素對(duì)照品溶液1、2、3、5、8、10 μL，分別按2.1 色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別得酸棗仁皂苷A、棗仁皂苷B、斯皮諾素的回歸方程為：y=10.87x+2.29（R2=0.999 9）、y=13.21x+2.02（R2= 0.999 5）、y=9.65x+3.27（R2=0.999 8）。結(jié)果表明酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、斯皮諾素的進(jìn)樣量在0.2 μg～2.0 μg 范圍內(nèi)都具有較好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別取酸棗仁皂苷A、B 混合對(duì)照品溶液、斯皮諾素對(duì)照品溶液各10 μL，按照2.1 色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、斯皮諾素等峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.88%、0.94%、0.64%，均小于2%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取酸棗仁芽品S9（萌發(fā)9 d）樣品5 份，按2.3 方法平行制備，按照2.1 色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果表明酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、斯皮諾素含量分別為0.15、0.75、4.64 mg/g；RSD 分別為1.57%、1.24%、0.92%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取酸棗仁皂苷A、B 混合對(duì)照品溶液、斯皮諾素對(duì)照品溶液，22 ℃放置，分別于制備好后的0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、斯皮諾素的峰面積RSD 分別為1.83 %、1.79%、1.50%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的酸棗仁芽品S9（第9 天，酸棗仁皂苷A 含量為0.15 mg/g、酸棗仁皂苷B 含量為0.75 mg/g、斯皮諾素含量為2.93 mg/g）1 g，平行6 份，按相當(dāng)于樣品溶液中酸棗仁皂苷A、B 和斯皮諾素含有量的100 %加入對(duì)照品。按2.3 樣品制備方法制得樣品溶液，按照2.1 條件測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B 和斯皮諾素的平均加樣回收率（n=6）分別為98.51%、98.88%、100.39%，RSD 分別為0.62%、0.35%、0.88%。結(jié)果詳見表1。

表1 樣品回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The recovery of the method

2.9 樣品的測(cè)定

分別取酸棗仁及萌發(fā)3、4、5、6、7、8、9、10 d 的芽品粉末，每份約1 g，精密稱定，按2.3 下同法制備成供試品溶液，分別精密吸取10 μL 注入色譜儀，記錄酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B 及斯皮諾素的峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

3 結(jié)論與討論

萌發(fā)是指種子吸脹后，內(nèi)部代謝作用增強(qiáng)，與種子萌發(fā)相關(guān)的基因開始表達(dá)，胚根逐漸伸長(zhǎng)并突破種皮的生物學(xué)過程，由外界環(huán)境因子、體內(nèi)激素含量及信號(hào)傳導(dǎo)和若干關(guān)鍵基因協(xié)同調(diào)控[9]。在萌發(fā)中，種子本身所含有的化學(xué)物質(zhì)又參與分解代謝或合成，從而使化學(xué)物質(zhì)的含量發(fā)生變化[10]。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸棗仁在萌發(fā)過程中，酸棗仁皂苷A 隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，含量明顯降低；酸棗仁皂苷B 隨著萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)含量明顯升高，并在萌發(fā)第7 天達(dá)到峰值，然后又稍有降低；斯皮諾素含量則先降低隨后升高到酸棗仁水平（萌發(fā)第6 天），然后隨萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)而降低。表明酸棗仁萌發(fā)時(shí)酸棗仁皂苷A、B 及斯皮諾素的含量變化與萌發(fā)時(shí)間具有一定的聯(lián)系，為酸棗仁芽品的質(zhì)量控制提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。從含量變化看，酸棗仁皂苷A、B 呈現(xiàn)一定的互補(bǔ)式增減，且酸棗仁皂苷A、B 結(jié)構(gòu)上的差異僅為一個(gè)葡萄糖，但萌發(fā)中是否由酸棗仁皂苷A 脫去一分子葡萄糖生成酸棗仁皂苷B 還有待于進(jìn)一步研究。

表2 萌發(fā)期酸棗仁皂苷A、B及斯皮諾素的動(dòng)態(tài)變化（n=2）Table 2 The jujuboside A，B and spinosin contents changed of seed of Ziziphus jujuba var.Spinosa at germination time（n=2）

酸棗仁皂苷及黃酮均具有較好的藥用價(jià)值，萌發(fā)中皂苷及黃酮的含量變化對(duì)酸棗仁芽在保健品和醫(yī)藥制品的研制方面是否有一定的開發(fā)價(jià)值，將進(jìn)一步通過藥理研究來闡述。綜上，該方法的穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性良好，適合于測(cè)定該酸棗仁芽品中酸棗仁皂苷A、B 及斯皮諾素的含量測(cè)定，為酸棗仁萌發(fā)中主要活性成分變化及酸棗仁芽品的質(zhì)量控制提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。