曾文杰，肖自勇，金晨鐘，柏連陽(yáng)，彭 瓊

(1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

稗草Echinochloa spp.隸屬于禾本科稗屬，全球已發(fā)現(xiàn)約15種稗草，我國(guó)報(bào)道有8種。稗草一直是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的十大惡性雜草之一，嚴(yán)重威脅作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，其中在我國(guó)僅水稻危害面積就達(dá)670萬(wàn)hm2，是中國(guó)水稻產(chǎn)區(qū)最主要的惡性雜草之一[1]。在過(guò)去的幾十年間，為克服稗草對(duì)作物安全生產(chǎn)的危害，農(nóng)田化學(xué)防治已成為全球現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要手段之一。然而，由于化學(xué)除草劑的過(guò)度依賴(lài)和長(zhǎng)期衍變，雜草抗藥性問(wèn)題日益突出，倍受全球關(guān)注[2]。

二氯喹啉酸屬于合成激素類(lèi)除草劑，是控制水稻田稗草生長(zhǎng)的優(yōu)秀除草劑之一，尤其對(duì)高齡稗草有特效[3]。自1995年二氯喹啉酸在湖南省洞庭湖與東江湖流域直播稻區(qū)大面積推廣應(yīng)用以來(lái)，其使用年限達(dá)二十年以上。許多地區(qū)已經(jīng)形成抗二氯喹啉酸的稗草種群，且部分地區(qū)抗性稗草對(duì)二氯喹啉酸的抗藥性指數(shù)達(dá) 600倍以上[4]?？剐园薏莘N群在我國(guó)稻區(qū)的蔓延擴(kuò)大，不僅直接影響水稻的產(chǎn)量與品質(zhì)，而且間接傳播水稻重要病蟲(chóng)害，嚴(yán)重威脅水稻安全生產(chǎn)與農(nóng)田生態(tài)環(huán)境。

生長(zhǎng)素(IAA)是最早發(fā)現(xiàn)的植物激素，主要在植物體中具有分生能力的莖尖、幼葉和根等組織器官中合成，在調(diào)節(jié)植物從胚胎發(fā)生到成熟的生長(zhǎng)進(jìn)程中起著決定性作用[5]。生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的GH3參與稗草對(duì)二氯喹啉酸產(chǎn)生抗藥性的過(guò)程[6]。目前，稗草對(duì)二氯喹啉酸產(chǎn)生抗性的機(jī)理研究主要集中在兩種假說(shuō)。一種認(rèn)為稗草1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(EcACO)和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶(EcACS)活性下降，短時(shí)間內(nèi)無(wú)法積累足夠的乙烯和有毒物質(zhì)氰化物[7—9]。在植株體內(nèi)產(chǎn)生乙烯和氰化物的過(guò)程經(jīng)過(guò)了生長(zhǎng)素信號(hào)通路[10—12]；然而，生長(zhǎng)素及其代謝途徑中的相關(guān)基因在稗草對(duì)除草劑產(chǎn)生高抗性過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚。另一種則認(rèn)為稗草對(duì)二氯喹啉酸產(chǎn)生抗性與β-氰丙氨酸合成酶(β-CAS)活性增強(qiáng)有關(guān)，抗性稗草主要通過(guò)提高氰化物解毒酶β-CAS的活性，從而控制有毒氰化物產(chǎn)生[13]。

本課題組以篩選得到的遺傳背景一致的二氯喹啉酸敏感型生物型(S)稗草及抗性生物型(R)稗草為材料進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)敏感型與抗性型稗草之間無(wú)論是在14C-二氯喹啉酸的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)、代謝水平上，還是乙烯代謝途徑中EcACO、EcACS的基因表達(dá)水平，亦或是β-CAS酶活及其基因表達(dá)水平上均無(wú)顯著差異(待發(fā)表)。本文通過(guò)外施二氯喹啉酸、生長(zhǎng)素處理，研究稗草對(duì)二氯喹啉酸產(chǎn)生抗性過(guò)程中的生長(zhǎng)發(fā)育及其生長(zhǎng)素含量變化，明確外源生長(zhǎng)素處理對(duì)敏感和抗性?xún)煞N生物型稗草材料產(chǎn)生的生態(tài)適合度差異，為下一步充分利用稗草基因組數(shù)據(jù)解析抗藥性產(chǎn)生的機(jī)理奠定基礎(chǔ)，以期為稗草綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為不同生物型稗草：二氯喹啉酸敏感型(S)、抗性型(R)，均采集于湖南省常德市鼎城區(qū)水稻田?？剐园薏輰?duì)二氯喹啉酸GR50(抑制稗草干物質(zhì)重50%所需藥劑劑量)抗性倍數(shù)＞78。試劑為75%二氯喹啉酸(美國(guó)Nufarm公司)，IAA(Sigma，純度大于98.0%)。

1.2 方法

選取飽滿(mǎn)的稗草種子，用98%濃硫酸浸泡處理4 min后，充分清洗干凈。然后將預(yù)處理后的稗草種子鋪在0.7%瓊脂板上，做好標(biāo)記。待稗草種子發(fā)芽長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)定植于花盆(21.5×21.5×45.0 cm)，每盆移栽15株，培養(yǎng)基質(zhì)為過(guò)篩稻田土∶營(yíng)養(yǎng)土=2∶1(V/V)。

待稗草長(zhǎng)至3葉期，利用3WP-2000型行走式噴霧塔TP6501E噴頭進(jìn)行藥劑處理，每處理設(shè)3次重復(fù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：①以800 g·hm-2(田間推薦劑量)二氯喹啉酸進(jìn)行莖葉處理(Q)；②0.1 mmol·L-1IAA溶液噴施處理30 min后，再進(jìn)行800 g·hm-2二氯喹啉酸的莖葉處理(Q+IAA)。以未進(jìn)行藥劑處理、正常生長(zhǎng)的稗草材料為對(duì)照(CK)。于處理后24 h取樣，測(cè)定植株高度(植株基部與最長(zhǎng)葉片葉尖之間的距離)、單株重量。蛋白濃度、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的測(cè)試盒測(cè)定。

生長(zhǎng)素含量(IAA)測(cè)定采用高效液相色譜法(HPLC法)；生長(zhǎng)素的提取參照Peng等[14]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。準(zhǔn)確稱(chēng)量植物樣品0.2000 g，液氮速凍后研磨成粉；加入1 mL 80%甲醇后充分混勻，于4 ℃冰箱中浸提過(guò)夜；次日12 000 g冷凍離心10 min，將上清液移至1.5 mL離心管中；殘?jiān)?.8 mL 80%甲醇重復(fù)浸提2次，每次浸提4 h，離心后合并3次上清液，冷凍濃縮至干；200 μL 0.1 mol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH 7.8)復(fù)溶樣品，超聲波振蕩至完全溶解；200 μL石油醚萃取，充分混勻，棄去上層醚相，保留下層水相，重復(fù)1次，至上層清澈無(wú)色為止；水相過(guò)自制的過(guò)濾柱，去除殘?jiān)?00 μL超純水重復(fù)洗滌過(guò)濾柱2次；C18柱中先加入1.0 mL 100%甲醇，待流干后重復(fù)1次，而后加入300 μL超純水，進(jìn)行C18柱的預(yù)平衡；植物樣本濾液經(jīng)過(guò)預(yù)平衡后的C18柱，300 μL超純水洗脫后，1.2 mL 80%甲醇洗脫并收集，冷凍濃縮至干，用于HPLC的分析。高效液相色譜法條件為：Waters C18分析柱(4.6 mm × 250 mm, 5 μm)，RF-10AXL熒光檢測(cè)器；流動(dòng)相用35%甲醇和65%的0.1%甲酸溶液，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm，柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL，根據(jù)外標(biāo)法定量。

數(shù)據(jù)作圖采用Microsoft Excel 2010，用SPSS數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氯喹啉酸對(duì)稗草生長(zhǎng)特性的影響

由表1可知，敏感型(S)和抗性型(R)稗草的植株高度及單株重量在苗期具有一定差異。在不施藥情況下，R型植株高度及單株重量分別比S型高45.5%和28.1%。二氯喹啉酸單獨(dú)處理24 h后，R型植株高度及單株重量分別比S型高54.6%和84.2%。二氯喹啉酸與IAA共同處理后，與S型相比，R型植株高度及單株重量分別提高68.3%和125%。

二氯喹啉酸和IAA處理24 h后，敏感型稗草(S)的植株高度及單株重量與對(duì)照無(wú)顯著差異；抗性型稗草(R)的植株高度在二氯喹啉酸和IAA處理24 h后，與對(duì)照相比也無(wú)顯著差異；二氯喹啉酸單獨(dú)處理、二氯喹啉酸與IAA共同處理后，R型稗草單株重量都顯著高于對(duì)照，分別比對(duì)照高70.7%和75.6%。

表1 二氯喹啉酸對(duì)稗草幼苗生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of quinclorac on seeding growth of barnyardgrass

2.2 二氯喹啉酸對(duì)稗草蛋白濃度的影響

二氯喹啉酸處理下，S型和 R型稗草幼苗中蛋白濃度與對(duì)照差異不顯著，蛋白濃度分別增加了24.8%和31.3%。在加入外源IAA的二氯喹啉酸處理下，與二氯喹啉酸單獨(dú)處理相比，S型稗草的蛋白濃度顯著降低了24.9%，R型稗草中的蛋白濃度無(wú)顯著變化；與對(duì)照相比，S型和R型稗草中的蛋白濃度均無(wú)顯著差異。在不施藥、二氯喹啉酸單獨(dú)處理、二氯喹啉酸與IAA共同處理的條件下，R型稗草蛋白濃度都比S型稗草高，分別高23.5%、29.8%和64.0%(圖1)。

2.3 二氯喹啉酸對(duì)POD活性的影響

由圖2所知，在兩種不同施藥處理下，S型和R型稗草體內(nèi)POD活性與對(duì)照均無(wú)顯著差異。二氯喹啉酸處理后，與對(duì)照相比，S型和R型稗草POD活性分別降低23.9%和25.0%；在二氯喹啉酸與IAA共同處理下，與對(duì)照相比，S型稗草POD活性提高8.2%，而R型稗草POD活性反而降低20.7%。

圖1 二氯喹啉酸對(duì)稗草蛋白濃度的影響Fig. 1 Effect of quinclorac on protein concentration of barnyardgrass

圖2 二氯喹啉酸對(duì)稗草POD活性的影響Fig. 2 Effect of quinclorac on POD activity of barnyardgrass

2.4 二氯喹啉酸對(duì)SOD活性的影響

兩種生物型稗草SOD活性測(cè)定表明(圖3)，R型稗草在兩種二氯喹啉酸處理?xiàng)l件下與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異。S型稗草SOD活性在二氯喹啉酸單獨(dú)處理24 h后比對(duì)照顯著提高29.6%；在二氯喹啉酸與IAA共同處理后SOD活性?xún)H增加3.5%，與對(duì)照無(wú)顯著差異。與二氯喹啉酸單獨(dú)處理相比，外施IAA的二氯喹啉酸處理下，S型稗草SOD活性降低20.2%，而R型稗草中SOD活性提高2.0%。

2.5 二氯喹啉酸對(duì)稗草生長(zhǎng)素含量的影響

S型稗草體內(nèi)生長(zhǎng)素含量在兩種施藥處理下與對(duì)照相比均無(wú)顯著變化，而R型稗草體內(nèi)的生長(zhǎng)素含量在各個(gè)處理之間變化顯著(圖 4)。與對(duì)照相比，二氯喹啉酸處理下，S型稗草中 IAA含量?jī)H提高25.6%，而R型稗草中IAA含量顯著增加3倍左右。與二氯喹啉酸單獨(dú)處理相比，在二氯喹啉酸與IAA共同處理下，S型稗草的IAA含量降低40.5%，而R型稗草IAA含量顯著提高109.1%。與對(duì)照相比，在二氯喹啉酸與IAA共同處理下，S型稗草的IAA含量降低25.3%，而R型稗草的IAA含量顯著增加7倍左右。

圖3 二氯喹啉酸對(duì)稗草SOD活性的影響Fig. 3 Effect of quinclorac on SOD activity of barnyardgrass

圖4 二氯喹啉酸對(duì)稗草體內(nèi)生長(zhǎng)素的影響Fig. 4 Effect of quinclorac on auxin in barnyardgrass

3 討論

二氯喹啉酸是防除稻田稗草的特效選擇性除草劑。二氯喹啉酸處理后會(huì)抑制植物生長(zhǎng)，導(dǎo)致植株幼嫩組織黃化，逐步失綠，最終死亡[11]。本研究的實(shí)驗(yàn)材料為課題組前期利用單株分蘗法篩選的遺傳背景一致的不同生物型(S型和R型)稗草。材料均通過(guò)兩代繁種、收種。在不施藥情況下，抗性型稗草植株高度及單株重量在苗期均高于敏感型稗草(表1)。

目前，雜草抗藥性機(jī)理的研究主要集中在非靶標(biāo)位點(diǎn)抗性(non-target-site resistance, NTSR)和靶標(biāo)位點(diǎn)抗性(target-site resistance, TSR)[15]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，敏感型與抗性型稗草在14C-二氯喹啉酸的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)、代謝水平上并無(wú)顯著差異。因此，稗草抗二氯喹啉酸的主要原因可能是生長(zhǎng)素代謝通路中某一靶標(biāo)位點(diǎn)的突變。同時(shí)，本課題組在14C-二氯喹啉酸的代謝研究中發(fā)現(xiàn)，S型和R型稗草在處理后的較短時(shí)間內(nèi)就能很快代謝二氯喹啉酸，且S型和R型稗草在代謝水平上無(wú)顯著差異(待發(fā)表)。因此，本研究選擇二氯喹啉酸處理24 h后進(jìn)行取樣及相關(guān)測(cè)定。無(wú)論是二氯喹啉酸單獨(dú)處理，還是與IAA共同處理，R型稗草的單株重量與對(duì)照相比分別提高70.7%和73.2%，這是R型稗草對(duì)二氯喹啉酸具有高抗藥性的生理基礎(chǔ)。二氯喹啉酸處理后，S型稗草的植株高度及單株重量與對(duì)照相比并未顯著降低，這說(shuō)明800 g·hm-2二氯喹啉酸處理24 h并未對(duì)S型稗草的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。相反，二氯喹啉酸單獨(dú)處理及外施 IAA的二氯喹啉酸處理均能顯著促進(jìn) R型稗草的平均鮮重。前期研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol·L-1IAA溶液噴施處理并不影響3葉期稗草植株的生長(zhǎng)發(fā)育(待發(fā)表)。與二氯喹啉酸單獨(dú)處理相比，外施IAA的二氯喹啉酸處理下，S型和R型稗草的植株高度有所下降，可能是外源生長(zhǎng)素IAA被植株吸收后影響植株體內(nèi)的生長(zhǎng)素信號(hào)通路，從而抑制稗草植株的生長(zhǎng)。

可溶性蛋白的親水膠體性質(zhì)強(qiáng)，能明顯增強(qiáng)細(xì)胞的持水力。可溶性蛋白質(zhì)的增加可以束縛更多的水分，同時(shí)減小逆境對(duì)植物產(chǎn)生的危害[16]。植物體內(nèi)可溶性蛋白是一種很好的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量可以反映植物對(duì)非生物脅迫的耐受能力[17]。本研究表明，抗性生物型稗草的蛋白濃度高于敏感性生物型稗草(圖1)，體現(xiàn)了R型稗草對(duì)非生物脅迫的高耐受能力。與二氯喹啉酸單獨(dú)處理相比，加入外源生長(zhǎng)素IAA的二氯喹啉酸處理后，S型和R型稗草的蛋白濃度均有所下降，S型稗草顯著降低24.9%，R型稗草僅降低5.1%，說(shuō)明加入外源IAA后，在二氯喹啉酸的影響下，S型稗草的蛋白質(zhì)合成受到抑制，S型稗草植株承受了較大的逆境危害。

當(dāng)遭受脅迫時(shí)，植物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧(ROS)從而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，相應(yīng)的植株體內(nèi)也有一套活性氧清除系統(tǒng)來(lái)保護(hù)植物免受危害，POD和SOD是植物體內(nèi)防御活性氧毒害的重要保護(hù)酶系[18—19]。本研究表明，在二氯喹啉酸單獨(dú)處理及外加IAA的二氯喹啉酸處理下，S型與R型稗草植株中POD活性與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異(圖2)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)二氯喹啉酸處理后植株本身防御酶系統(tǒng)的POD未發(fā)揮主要的保護(hù)作用。與對(duì)照相比，R型稗草SOD活性變化較小，說(shuō)明其清除自由基的能力較強(qiáng)；S型稗草中的SOD活性顯著提高了29.6%(圖3)，表明S型稗草受到的活性氧傷害大，因而提高了自身的SOD活性[20]，而在施入外源IAA后，S型稗草POD活性與對(duì)照和單獨(dú)二氯喹啉酸處理相比升高了，說(shuō)明IAA能夠通過(guò)提高敏感性稗草POD活性來(lái)抵御脅迫；R型稗草SOD、POD活性與其他處理相比變化幅度較小，說(shuō)明IAA對(duì)抗性稗草的SOD、POD活性影響較小。

生長(zhǎng)素能夠促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育及細(xì)胞分裂，同時(shí)還能夠提高植物抗逆境脅迫的能力[21]。植物在受到逆境脅迫時(shí)，其體內(nèi)的激素含量會(huì)發(fā)生變化，生長(zhǎng)素作為植物激素，必然與逆境脅迫有著聯(lián)系[22]。本研究中，在不施藥、二氯喹啉酸單獨(dú)處理、二氯喹啉酸與IAA共同處理的條件下，S型稗草體內(nèi)的生長(zhǎng)素含量變化幅度較小。與對(duì)照相比，R型稗草在二氯喹啉酸單獨(dú)處理下生長(zhǎng)素顯著增加3倍，在二氯喹啉酸與IAA共同處理下生長(zhǎng)素顯著增加7倍，說(shuō)明IAA含量增加對(duì)高抗二氯喹啉酸稗草的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。