王洪洋，劉 晶，董金美，張婷婷，鄭楠楠，嚴(yán) 懿，李燦輝

(1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院，云南 昆明 650500)

馬鈴薯Solanum tuberosum起源于南美洲安第斯山山脈一帶，屬于茄科茄屬植物。馬鈴薯種質(zhì)資源豐富，主要分布在秘魯和玻利維亞一帶，有1個普通栽培種、7個近緣栽培種和228個野生種。我國是世界上馬鈴薯種植面積最大的國家，馬鈴薯已成為我國僅次于水稻、小麥和玉米的第四大主糧[1]。然而，由致病疫霉菌Phytophthora infestans引起的馬鈴薯晚疫病嚴(yán)重威脅著全球馬鈴薯生產(chǎn)安全，嚴(yán)重時導(dǎo)致馬鈴薯大幅度減產(chǎn)[2]。晚疫病造成全球馬鈴薯每年減產(chǎn)至少15%，損失達100多億美元[3]。目前，晚疫病的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，然而大量使用藥劑不僅污染環(huán)境，還會加速病菌產(chǎn)生抗藥性和加快突變進程。因此，迫切需要一種穩(wěn)定而持久的方法來對抗晚疫病的侵害，選育具有廣譜抗性的馬鈴薯種質(zhì)資源成為防治晚疫病的必然趨勢。

早在20世紀(jì)50年代國外就開始對馬鈴薯晚疫病抗性鑒定進行深入研究，而我國直到21世紀(jì)初才開展鑒定研究工作[4]，近幾年來陸續(xù)鑒定了一批抗病的馬鈴薯種質(zhì)材料[5—8]。馬鈴薯野生種資源中含有豐富的抗病資源[9—10]，如 S. demissum[11—14]、S. bulbocastanum[15—17]、S. venturii[18]等。然而，由于 P. infestans群體極易變異并能克服大部分馬鈴薯抗性基因，超級生理小種極有可能出現(xiàn)，進而導(dǎo)致現(xiàn)有抗病品種抗性喪失[19—20]。因此，急需擴大對馬鈴薯抗病資源的篩選、鑒定，特別是對研究較少的安第斯山栽培亞種馬鈴薯資源的篩選、鑒定。本研究利用離體葉片接種法對國內(nèi)外收集和引進的43份馬鈴薯種質(zhì)資源進行晚疫病抗性鑒定，以期獲得對晚疫病具有廣譜抗性的馬鈴薯種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

43份馬鈴薯資源包括28份野生種、8份原始栽培種S. phurejia和7份安第斯山栽培亞種，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所和云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院提供。感病對照為馬鈴薯品種‘Désirée’[21]，由云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院提供?？共φ諡轳R鈴薯品種‘加湘1號’[8]，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所提供。所有材料無菌試管苗在含有4%蔗糖的MS培養(yǎng)基中繁殖，待試管苗生長30 d后移栽于溫室塑料缽(20 cm×20 cm)中，澆水、施肥等按日常管理。將生長2個月健康無機械損傷的葉片用于接種。

晚疫病菌菌株HB09-14-2(生理小種：1.2.3.4.5.6.7. 9.10.11，A1A2交配型)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯實驗室饋贈，接種于黑麥培養(yǎng)基上并在18 ℃培養(yǎng)。

1.2 晚疫病菌孢子懸浮液制備

取18 ℃平板培養(yǎng)20 d的新鮮晚疫病菌，用少量無菌水洗脫晚疫病菌孢子囊，并用血球計數(shù)板測定孢子囊濃度約1×105個· mL-1，將調(diào)整好濃度的孢子囊放置于4 ℃條件下促使游動孢子釋放，備用。

1.3 離體葉片接種

采用離體葉片接種法進行晚疫病抗性鑒定[22]。待馬鈴薯苗生長2個月后，從健康植株上選取長勢一致的葉片，用蒸餾水沖洗干凈。先將濕潤濾紙片放入接種盤中，然后將馬鈴薯葉背面朝上置于濾紙上，取10 μL配制好的游動孢子懸浮液分別接種于葉片主脈左右兩側(cè)，每份馬鈴薯材料接種10片葉，3次重復(fù)。將接種盤置于18～20 ℃培養(yǎng)室中黑暗保濕24 h， 此后將光周期調(diào)整為16 h/8 h(光照/黑暗)。

1.4 離體葉片接種調(diào)查

接種5 d后進行調(diào)查，先觀察感病對照葉片癥狀和抗病對照葉片接種部位是否有過敏反應(yīng)，然后對不同馬鈴薯種質(zhì)資源葉片進行病斑面積和葉片總面積測量，計算出病斑占整個葉片總面積的百分比。評級標(biāo)準(zhǔn)參照婁樹寶等[5]的標(biāo)準(zhǔn)(表1)。

表1 馬鈴薯晚疫病的抗性評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Resistant evaluation criteria of potato to late blight

2 結(jié)果與分析

43份馬鈴薯種質(zhì)資源對晚疫病菌HB09-14-2的抗性鑒定結(jié)果如圖1和表2所示。通過離體葉片接種，發(fā)現(xiàn)3份S. phurejia材料(No. 1、No. 2、No. 3)和2份S. tuberosum ssp. andigena材料(No. 4、No. 5)對HB09-14-2表現(xiàn)為高抗，其接種部位同抗病對照‘加湘1號’一樣出現(xiàn)過敏反應(yīng)(圖1)。另外，還鑒定出1份抗病材料(No. 6)，14份中抗材料(No. 7～No. 20)，21份感病材料(No. 21～No. 41)，2份高感晚疫病材料(No. 42、No. 43)。

圖1 晚疫病菌接種部分馬鈴薯種質(zhì)資源的表現(xiàn)Fig. 1 Symptoms of potato leaves inoculated Phytophthora infestans

表2 供試馬鈴薯種質(zhì)資源晚疫病抗性鑒定Table 2 Resistant evaluation of potato germplasm to Phytophthora infestans

3 討論

隨著中國馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的推進，馬鈴薯品種的優(yōu)劣將在馬鈴薯生產(chǎn)中起著關(guān)鍵作用。雖然目前投入使用的抗病品種已有不少，但馬鈴薯晚疫病疫情仍不時爆發(fā)。P. infestans生理小種不斷變異，使得普通的抗病材料難以具備持久的抗病能力，已選育的馬鈴薯品種正逐漸喪失作用[23—25]。因此，晚疫病種質(zhì)資源的抗性鑒定和持久抗病材料的發(fā)掘?qū)⒊蔀檫x育高品質(zhì)抗晚疫病馬鈴薯品種的重要課題。

本研究采用離體葉片接種法，對28份野生種、8份原始栽培種S. phurejia和7份安第斯山栽培亞種馬鈴薯種質(zhì)資源進行晚疫病的抗性鑒定，篩選出5份對強致病性晚疫病菌菌株HB09-14-2表現(xiàn)為高抗的材料(3份S. phurejia材料和2份S. tuberosum ssp. andigena材料)。雖然本試驗未能對這5份材料進行田間自然病圃鑒定，但是相關(guān)研究表明，離體葉片法鑒定結(jié)果基本可反映馬鈴薯材料在田間的抗性水平[4]。本研究發(fā)現(xiàn)的5份對晚疫病表現(xiàn)高抗性的馬鈴薯種質(zhì)資源，包括3份原始栽培種和2份安第斯山栽培亞種。該發(fā)現(xiàn)證實了栽培種和安第斯山亞種馬鈴薯中存在高抗晚疫病種質(zhì)資源[26]。針對這5份高抗晚疫病資源，后續(xù)將采用混合接種P. infestans生理小種進行進一步的抗病鑒定及田間抗性評價，以期篩選出廣譜、持久的抗晚疫病資源。此外，新篩選出的抗病資源的抗病基因鑒定、作用機制及其蛋白功能等均值得深入研究。