廉佳佩，段喬健，張 云，焦樂(lè)樂(lè)，李曉軍，延文星，張弘弛

(山西大同大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009)

甲醛可以危害到人體的很多方面：其一，甲醛可以直接通過(guò)外部皮膚接觸引發(fā)病癥，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致皮膚壞死。其二，甲醛濃度超標(biāo)一般會(huì)引起呼吸道疾病，這是因?yàn)榧兹┠芘c人體呼吸道蛋白質(zhì)結(jié)合，從而對(duì)人體呼吸道造成傷害。目前，甲醛污染的問(wèn)題引起了國(guó)內(nèi)外諸多專家學(xué)者的重視，生物降解的方法在近年來(lái)引起了國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者的關(guān)注，生物法降解甲醛具有高效低成本的優(yōu)點(diǎn)，而且方法簡(jiǎn)單、更加環(huán)保[1-2]。雖然生物法降解甲醛引起了人們的關(guān)注，但是如今對(duì)于降解甲醛的特殊微生物菌種的研究相對(duì)來(lái)說(shuō)還是比較少的，綠蘿作為生活中常見的具有凈化甲醛作用的植物，被稱為“生命之花”，從其內(nèi)生真菌中分離出對(duì)甲醛具有降解作用的真菌對(duì)于解決甲醛污染問(wèn)題，凈化生活環(huán)境有重要的作用。

1 材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品選為市面銷售的普通綠蘿，并將其放置于甲醛濃度高于國(guó)家甲醛標(biāo)準(zhǔn)0.1 mg/L的新裝修室內(nèi)培養(yǎng)15 d作為實(shí)驗(yàn)樣品。

1.2 培養(yǎng)基成分

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然。

改良察式選擇培養(yǎng)基：硫酸銨1.00 g，磷酸氫二鉀2.16 g，硫酸鎂0.10 g，磷酸二氫鉀0.85 g，硫酸鎂0.05 g，氯化鈣0.03 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1000 mL，pH值7.0。

察氏培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1000 mL，pH自然。

1.3 儀器設(shè)備及試劑

DHP-600電熱恒溫培養(yǎng)箱(金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠)，LS-7SHD全自動(dòng)數(shù)顯立式高壓蒸汽滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)，SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)(昆明普康儀器儀表有限公司)，XMA-600鼓風(fēng)干燥箱(余姚市亞泰儀表有限公司)，GW-D恒溫?fù)u床(北京市六一儀器廠)，UV-3200S紫外/可見分光光度計(jì)(上海美國(guó)譜達(dá)儀器有限公司)，SK210digitall生物顯微鏡(麥克奧迪事業(yè)集團(tuán)有限公司)；乙酰丙酮溶液、37%甲醛溶液、75%乙醇、3%次氯酸鈉溶液、無(wú)菌水、蒸餾水等。

2 方法

2.1 樣品的處理

在綠蘿盆栽樣品上剪取正常生長(zhǎng)的綠蘿葉片，在流水下沖洗葉片表面污物后再用無(wú)菌水沖洗干凈，然后使其自然風(fēng)干。風(fēng)干后對(duì)葉面表面進(jìn)行消毒處理，-步驟如下：先用75%的乙醇溶液浸泡15～30 s，然后用3%的次氯酸鈉溶液浸泡10 s，最后再于75%的乙醇溶液中浸泡10 s后用無(wú)菌水沖洗2～3次。

2.2 菌種富集培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下將葉片剪碎后，放置于已滅菌的研缽中研磨成漿，取5 g綠蘿葉片漿液，接種于100 mL的PDA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，于28 ℃、150 r/min的條件下的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)10 d。

2.3 甲醛降解菌的篩選

2.3.1 培養(yǎng)基的選擇及甲醛溶液的處理

改良察氏選擇培養(yǎng)基為此步驟所用的培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌后，待培養(yǎng)基凝固的同時(shí)，在無(wú)菌條件下進(jìn)行甲醛溶液的配制，分別配制質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200 mg/L的甲醛溶液。

2.3.2 唯一碳源甲醛的添加

待培養(yǎng)基徹底冷卻凝固后，吸取10 μL不同濃度的甲醛溶液滴在固體培養(yǎng)基中央，用三角涂布棒將甲醛溶液推向培養(yǎng)皿四周使其均勻分布，每個(gè)濃度涂布兩個(gè)培養(yǎng)基以便作為重復(fù)試驗(yàn)，并在培養(yǎng)皿上貼上標(biāo)簽，標(biāo)示出甲醛溶液的濃度。同時(shí)以不添加甲醛而添加無(wú)菌水的培養(yǎng)基作為對(duì)照。待涂布的甲醛溶液在培養(yǎng)基上完全滲下后，用移液管吸取富集培養(yǎng)液的上清液0.5 mL于固體培養(yǎng)基上，同樣用三角涂布棒涂布均勻，在30 ℃培養(yǎng)5 d。

2.3.3 甲醛降解菌的分離純化

將培養(yǎng)5 d后的菌種在改良察氏選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線操作，在培養(yǎng)基的背面用記號(hào)筆標(biāo)記出劃線的四個(gè)區(qū)域，在第四區(qū)域得到所需菌落。繼續(xù)在改良察氏選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行多次的純種劃線操作，直至得到純的單株菌落。

2.3.4 甲醛降解性能的鑒定

將分離純化得到的單株菌種接種于甲醛質(zhì)量濃度為90 mg/L的改良察氏選擇液體培養(yǎng)基中，以不加入甲醛而加入無(wú)菌水的培養(yǎng)基[3]為對(duì)照，在28 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)一周，驗(yàn)證該菌種對(duì)甲醛的降解性。

2.4 甲醛降解菌E.a-03的鑒定

將分離純化出的單株菌落利用點(diǎn)殖法接種于察氏培養(yǎng)基上。在點(diǎn)接菌落時(shí)，用接種環(huán)挑取少量菌種，輕輕點(diǎn)在固體培養(yǎng)基適宜的三個(gè)位置上(成三角形狀分布)。接種菌種后，于28 ℃培養(yǎng)，從3 d后開始觀察其菌落形態(tài)并且記錄其外觀變化和色素產(chǎn)生情況；采用插片培養(yǎng)法觀察菌種的菌絲、孢子囊及孢子等形態(tài)[4-5]。將分離純化得到的對(duì)甲醛有降解作用的綠蘿內(nèi)生真菌接種于察氏培養(yǎng)基的試管斜面上培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后交于測(cè)試公司進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，將測(cè)序后的ITS序列經(jīng)Blast比對(duì)，在進(jìn)行該菌種系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2.5 甲醛降解菌E.a-01的生長(zhǎng)曲線及甲醛降解曲線的測(cè)定

以改良察氏選擇液體培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中加入濃度為90 mg/L的甲醛溶液作為該菌種可以吸收的唯一碳源，按照10%的接種量[6]用已經(jīng)滅菌的移液管吸取種子液于150 mL的改良察氏選擇液體培養(yǎng)基中，共接種52瓶培養(yǎng)基。封口前先吸取2 mL清液測(cè)其降解前的吸光度值OD0并記錄，封口后在恒溫?fù)u床中28 ℃、150 r/min培養(yǎng)20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200 h時(shí)，于每個(gè)時(shí)間取出3瓶，過(guò)濾得到菌絲體于55 ℃烘箱中干燥9 h后，分別在電子天平上稱量菌絲干重并取平均值得到每個(gè)生長(zhǎng)時(shí)間段的平均菌絲干重，記錄數(shù)據(jù)。

2.6 甲醛降解曲線的測(cè)定[7]

取出培養(yǎng)液過(guò)濾后得上清液，用移液管吸取2 mL上清液于25 mL的具塞試管中，然后加入2.5 mL的乙酰丙酮溶液后用振蕩器將二者混合均勻后向試管中加入蒸餾水至刻度線，在100 ℃中水浴15 min，待冷卻后于波長(zhǎng)414 nm下測(cè)量其吸光度，以蒸餾水為參照，測(cè)出降解后甲醛的吸光度值OD1。測(cè)得降解前后甲醛的吸光度值后，利用公式：降解率(%)=(1-OD1/OD0)×100計(jì)算出培養(yǎng)過(guò)程中不同時(shí)間段甲醛的降解率并記錄數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 降解菌鑒定結(jié)果

圖1 E.a-01菌落特征和顯微結(jié)構(gòu)

Fig.1 Colony characteristics and microstructure of E.a-01

圖2 E.a-01的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過(guò)對(duì)綠蘿內(nèi)生真菌的篩選，經(jīng)過(guò)多次分離純化得到一株對(duì)甲醛具有降解性能的菌株E.a-01。該株菌種的菌絲生長(zhǎng)較為疏松，菌絲大多呈毛絮狀生長(zhǎng)，培養(yǎng)3 d時(shí)菌落表面呈白色；5 d左右逐漸由色素積累，菌落開始呈現(xiàn)淡青色；培養(yǎng)至7 d時(shí)，菌落直徑達(dá)到38～50 mm，菌落表面顏色有明顯分別，中間顏色較深呈現(xiàn)黃褐色，外部顏色為青綠色，邊緣菌絲呈現(xiàn)白色；長(zhǎng)至12 d菌落鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿，從背面觀察菌落呈現(xiàn)白綠色(圖1)。經(jīng)過(guò)對(duì)該菌株的玻片進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)E.a-01的菌絲較為發(fā)達(dá)，分枝多且明顯，為有隔菌絲，孢子囊呈球形，孢子較分散(圖1)。

經(jīng)過(guò)對(duì)該菌株的測(cè)序分析，菌株 E.a-01的ITS序列長(zhǎng)度為591bp，菌株E.a-01的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。BLAST比對(duì)結(jié)果表明，E.a-01的rRNA-ITS序列和Penicilliumdipodomyicola的序列相似。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，E.a-01與Penicilliumdipodomyicola屬于同一分枝。再結(jié)合該菌株的形態(tài)學(xué)特征及其顯微結(jié)構(gòu)，可將E.a-01鑒定為青霉Penicilliumdipodomyicola。

3.2 綠蘿內(nèi)生真菌 E.a-01的生長(zhǎng)曲線和甲醛降解曲線

圖3 內(nèi)生真菌 E.a-01的生長(zhǎng)曲線與甲醛降解率曲線

從圖3中我們可以明顯的看到，內(nèi)生真菌 E.a-01的生長(zhǎng)曲線與其甲醛降解率曲線在培養(yǎng)時(shí)間20～200 h的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本上一致。在20～70 h期間，該菌株的生長(zhǎng)狀況和其對(duì)甲醛的降解率均處于較低的狀態(tài)，且增長(zhǎng)幅度不明顯，培養(yǎng)50 h后細(xì)菌干重僅增加0.879 g，而對(duì)于甲醛的降解率僅由4.7%增長(zhǎng)到14.7%?？梢哉f(shuō)細(xì)胞在此期間的增長(zhǎng)處于延滯狀態(tài)；當(dāng)菌體培養(yǎng)到70 h之后，生長(zhǎng)曲線和甲醛降解率曲線均有明顯的變化，在70～100 h期間，菌體開始大量生長(zhǎng)，而其對(duì)于甲醛的降解率也開始逐步的上升，說(shuō)明在此期間菌種開始逐漸的適應(yīng)生長(zhǎng)條件；當(dāng)培養(yǎng)菌體至100 h后，菌體開始出現(xiàn)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的情況，在100～160 h期間，菌體干重由1.694 g上升至2.870 g，甲醛降解率也由27.8%上升至84.7%，此時(shí)菌體對(duì)于甲醛的降解率達(dá)到最大。在培養(yǎng)160 h之后，細(xì)胞開始逐漸衰亡，菌體干重下降較快，而該菌種對(duì)于甲醛的降解率呈現(xiàn)直線下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)至200 h時(shí)，菌絲干重下降至1.951 g，而該菌種對(duì)于甲醛的降解率則直接下降至41.7%，接近于最高甲醛降解率的一半。說(shuō)明在培養(yǎng)至160 h之后，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及菌體本身代謝的減緩，使得細(xì)胞開始自溶逐漸走向死亡。綜上所述，綠蘿內(nèi)生真菌 E.a-01的培養(yǎng)時(shí)間處于140～160 h時(shí)，菌體生長(zhǎng)最為茂盛，處于菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

4 討論

將內(nèi)生真菌E.a-01與其他高效甲醛降解菌相比，該菌的甲醛耐受力以及對(duì)于甲醛的降解效率與高效甲醛降解菌還有很大的差距。在后續(xù)的試驗(yàn)工作中，期望可以結(jié)合基因育種的方法改良該菌株的基因，進(jìn)而可以提高其對(duì)甲醛的耐受力并且進(jìn)一步提高該菌株對(duì)于甲醛的降解效率，希望可以將內(nèi)生真菌發(fā)展成為較為高效的甲醛降解菌，為當(dāng)今化工行業(yè)、家裝污染以及廢水處理提供更為高效，更為簡(jiǎn)便，更為環(huán)保的方法。