李佳懌，米士麗，張 瑞，陶 然，毛近隆

(1.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.南京中醫(yī)藥大學 藥學院，江蘇 南京 210000；3.山東中醫(yī)藥大學實驗中心，山東 濟南 250355)

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)屬昆蟲綱蜚蠊目蜚蠊科，在《本草綱目》記載“蜚蠊，行夜，蛗螽三種，西南夷皆食之。”《神農本草經》，其性寒味咸，有小毒，具有散瘀，化積，解毒，通利血脈之功效[1]。美洲大蠊的藥用價值非常豐富，目前報道較多有蛋白質和多糖類成分，某些蛋白質具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、調節(jié)免疫等作用，在多糖中的糖胺聚糖具有抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、降血脂等作用[2-3]，蛋白質與多糖在美洲大蠊體內常以共價結合的方式存在[4-6]，在生物藥物研發(fā)中日益受到人們青睞。

目前美洲大蠊中活性成分的提取研究，對蛋白質和多糖有少量文獻報道，但對糖胺聚糖尚未見到文獻報道。本試驗將美洲大蠊通過水提酶解法提取，總蛋白質通過改良lowry法測定，糖胺聚糖通過阿利新藍染色法測定，以總蛋白質及糖胺聚糖提取率為雙指標，考查提取料液比、時間和溫度等因素，篩選最佳提取條件，為美洲大蠊進一步加工炮制和藥理研究提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

美洲大蠊為臨沂采購，經山東中醫(yī)藥大學高德民教授鑒定為正品；胰蛋白酶、硫酸軟骨素、阿利新藍、硫酸、磷酸、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器

HW1型電熱恒溫水溫箱(北京醫(yī)療設備廠)；KQ-500E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；ST-16R 高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司)；FA1004N 電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；UV9100B型紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

將美洲大蠊清洗、勻漿、冷凍干燥、粉碎、過40目篩備用。精密稱取美洲大蠊粉6份，每份1.0000 g，分別加入到100 mL具塞錐形瓶中，按一定料液比加入蒸餾水，超聲提取20 min，超聲溫度為50 ℃，加入胰蛋白酶2000 U(酶活力50000 U/g)，調節(jié)pH值為8，在37 ℃下酶解3 h[7]，每小時調一次pH值，并在一定溫度和超聲時間下進行超聲提取，提取液在3000 r/min離心10 min，將上清液抽濾，并定容到100 mL容量瓶中，得到美洲大蠊的供試品溶液[8-10]。

2.2 總蛋白和糖胺聚糖的測定

2.2.1 總蛋白標準曲線繪制

參考文獻方法[11]，采用改良lowry法測定總蛋白的含量，以吸光度為縱坐標，牛血清蛋白濃度為橫坐標，得標準曲線回歸方程為Y=2.3305X+0.0084，相關系數r=0.9986，表明牛血清蛋白標準溶液在吸光度線性范圍內成良好線性關系。

2.2.2 糖胺聚糖標準曲線繪制

參考文獻方法[12]，采用阿利新藍染色法測定糖胺聚糖的含量，以吸光度為縱坐標，硫酸軟骨素濃度為橫坐標，得標準曲線回歸方程為Y=1.1345X+0.0038，相關系數r=0.9983，表明硫酸軟骨素標準溶液在吸光度線性范圍內成良好線性關系。

2.2.3 提取率的計算

取步驟“2.1”所得供試品溶液，按照測定上述方法測定吸光度，計算總蛋白和糖胺聚糖的含量，總蛋白或糖胺聚糖的提取率為吸光度測定含量與美洲大蠊總質量之比。

總蛋白或糖胺聚糖提取率(%)=1000Y/m

式中Y為吸光度，m為稱取樣品質量(mg)。

2.2.4 綜合評分

糖胺聚糖與蛋白質為美洲大蠊水提液中有效成分，設定兩者權重系數均為1。提取工藝優(yōu)化過程中，先算出糖胺聚糖及總蛋白質的提取率，再根據下列公式計算綜合評分。

式中X＇為標注化處理后的值即綜合評分，X為指標的測量值，為不同試驗號中該指標測量值的平均值，S為不同試驗號中該指標測量值的標準偏差。

2.3 提取工藝的篩選

在單因素試驗的基礎上,參考前期研究將pH值設定為8，選定料液比、超聲時間與提取溫度三個因素為自變量，蛋白質及糖胺聚糖的提取率為響應值，采用三因素三水平響應面分析法進行試驗設計(表1)，對糖胺聚糖及蛋白質提取工藝進行篩選。

2.3.1 料液比的影響

在確保提取pH值為8、溫度為50 ℃、提取時間80 min的條件下，改變提取料液比為1∶30 1∶70 g·mL-1進行超聲水提，考察料液比對總蛋白及糖胺聚糖提取率的影響。

2.3.2 溫度的影響

在確保料液比1∶40 g·mL-1，提取時間為80 min、pH值=8不變下，改變超聲儀器溫度，在溫度為30～70 ℃下超聲水提，考察提取溫度對總蛋白及糖胺聚糖提取率的影響。

2.3.3 超聲時間的影響

在確保液料比1∶40 g·mL-1，提取溫度50 ℃、pH值=8不變下，改變提取時間，在提取時間為60～100 min下超聲水提，考察提取時間對糖胺聚糖及總蛋白提取率的影響。

表1 因素水平表

3 結果與分析

3.1 正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，對提取料液比、超聲時間與提取溫度三個因素進行正交試驗，總蛋白的提取率為25.94%～28.34%，糖胺聚糖的提取率為1.76%～2.42%。結果見表2。實驗數據用SPSS17.0進行方差分析，篩選最佳提取工藝條件為A1B1C1，其中總蛋白質的提取率為27.79%、糖胺聚糖的提取率為2.31%，方差分析結果見表3。

表2 正交試驗設計與結果

表2(續(xù))

表3 方差分析

注：P<0.05表示有顯著性差異。

3.2 單因素試驗考察

3.2.1 料液比對提取率的影響

由圖1可知，總蛋白和糖胺聚糖的提取率隨料液比的增加同樣呈現先上升后略下降的趨勢，在料液比1∶50 g·mL-1時達到最高值。糖胺聚糖得率隨料液比的增加呈現先升高后降低的趨勢，在料液比為1∶20～1∶40 g·mL-1范圍內糖胺聚糖得率呈現逐步升高趨勢，由此可見當溶劑用量不足時不能將有效成分充分溶出，而當料液比提升至1∶40～1∶60 g·mL-1范圍時糖胺聚糖得率略有下降，可能由于溶劑量過高導致超聲效果充分發(fā)揮，從而降低糖胺聚糖得率。綜合雙指標試驗結果，料液比選擇1∶30～1∶50 g·mL-1范圍較為合適。

圖1 料液比對美洲大蠊總蛋白及糖胺聚糖提取率的影響

3.2.2 超聲時間對提取率的影響

圖2 超聲時間對美洲大蠊總蛋白及糖胺聚糖提取率的影響

由圖2可知，總蛋白質提取率隨提取時間的增長，在60～100 min基本保持平穩(wěn)，時間對蛋白提取率的影響不明顯。糖胺聚糖的提取率隨時間增長呈現先升高后降低的趨勢，在60～80 min范圍內，糖胺聚糖提取率不斷提升，推斷為隨時間延長，超聲促進細胞破裂，有利于細胞內糖胺聚糖的溶出；而糖胺聚糖提取率于80～100 min 時呈現下降趨勢，可能由于產生時間過長導致糖胺聚糖結構被破壞，糖鏈斷裂，使糖胺聚糖提取率下降。綜合雙指標試驗結果，選擇超聲時間70～90 min較為合適。

3.2.3 提取溫度對提取率的影響

由圖3可知，總蛋白質的提取率隨著溫度的升高，在30～70 ℃區(qū)間內呈現緩慢增長，隨溫度升高蛋白質逐漸增加，溫度超過60 ℃時部分蛋白開始變性，蛋白質的含量反而減小。糖胺聚糖提取率隨溫度的不斷提升，呈現先升高后降低的趨勢，在50 ℃時糖胺聚糖提取率達到最高值，溫度超過50 ℃范圍內呈下降趨勢，推斷溫度過高會破壞糖胺聚糖間糖苷鍵，使糖胺聚糖含量降低。綜合雙指標試驗結果，選擇溫度40～60 ℃較為合適。

圖3 溫度對美洲大蠊總蛋白及糖胺聚糖提取率的影響

上述結果分析表明,美洲大蠊水提液中總蛋白提取率，與溫度和料液比的關系較明顯，而糖胺聚糖的提取率與溫度和提取時間的關系較明顯。判斷各因素對美洲大蠊水提有效成分的影響因素大小為超聲時間>溫度>料液比，得到最優(yōu)工藝條件為A1B1C1。

4 討論

本實驗在單因素考察的基礎上，通過正交實驗優(yōu)選出美洲大蠊蛋白質和糖胺聚糖雙指標的最佳提取工藝：精密稱取美洲大蠊1.0000 g，按1∶30料液比加入蒸餾水，超聲提取20 min，超聲溫度為50 ℃，加入胰蛋白酶2000 U(酶活力50000 U/g)，調節(jié)pH值為8，在37 ℃下酶解3 h后，在40 ℃超聲提取70 min得提取液，紫外光譜法測得糖胺聚糖提取率為2.31%、總蛋白質提取率為27.79%以上，綜上本實驗制備工藝簡單，利用胰蛋白酶進行水提酶解，制備糖胺聚糖及蛋白質得率較高，對臨床炎癥、腫瘤等疾病治療提供優(yōu)選藥液制備工藝。