秦毅斌，蘇乾蓮，趙 碩,2，梁家幸，李 斌，盧冰霞，周展宏，陳忠偉，何 穎，段群棚，周英寧，蔣冬福，趙 武*

(1.廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530001；2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

【研究意義】豬捷申病毒 (Porcine teschovirus，PTV)屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)捷申病毒屬(Teschovirus)成員，病毒粒子呈球形，外層包裹衣殼，無脂蛋白，其基因組為單股正鏈RNA，長約7.2 kb，僅含有1個完整的開放閱讀框(ORF)。ORF編碼1個多聚蛋白，該產(chǎn)物可被蛋白水解酶裂解為結(jié)構(gòu)蛋白L、VP1、VP2、VP3、VP4和非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3 A、3B、3C、3D[1-3]。PTV可導(dǎo)致感染豬發(fā)生豬捷申病(Porcine Teschen disease，PTD)，又稱塔爾凡病(Talfan disease)或腦脊髓炎(Encephalomyelitis)，豬群感染PTV產(chǎn)生的臨床癥狀與豬腸道病毒相似[4]。豬群感染PTV后，主要表現(xiàn)為腹瀉、腦脊髓炎[5]、肺炎、心包炎、心肌炎等癥狀，母豬還可發(fā)生繁殖障礙，表現(xiàn)為不孕、死產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎等[6]。1929年P(guān)TD暴發(fā)于原捷克斯洛伐克的捷申城，隨后流傳至北美、澳大利亞和日本等國，目前已分布世界各地。目前，國內(nèi)豬群感染PTV僅有少量報(bào)道，開展廣西受檢豬腹瀉病例PTV感染檢測診斷研究，對廣西PTD的監(jiān)測、預(yù)警及防控均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】豬是PTV的唯一宿主，PTV至少有11個血清型[7-8]，近年研究表明存在新的血清型PTV12[9]、PTV13[10]。2003年，我國哈爾濱獸醫(yī)研究所從內(nèi)蒙古某豬場首次分離到PTV Swine/CH/IMH/03株[11]。隨后，我國黑龍江省、吉林省、河北省、廣東省、江西省分別分離到了PTV JF613株、jilin/2003株、PTV HB株、PT-GD株、CH/JX/JA株和CH/JX/JJ株，并進(jìn)行了全基因組測定與分析[12-16]。2018年3月，廣西某豬場斷奶仔豬出現(xiàn)腹瀉，本課題組細(xì)菌分離結(jié)果顯示除大腸桿菌外，未見其它有意義的致病菌；PCR檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎、豬A群輪狀病毒、豬C群輪狀病毒、豬丁型冠狀病毒等常見引起豬腹瀉的主要腸道病毒性疫病病毒均為陰性。檢測排除了其它細(xì)菌性和病毒性疫病病原感染，通過病毒細(xì)胞分離培養(yǎng)，并通過PTV VP1基因擴(kuò)增測序(GenBank登錄號：MN075145)，證實(shí)該病例為PTV感染導(dǎo)致的仔豬腹瀉?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在前期研究基礎(chǔ)上，并通過GenBank中登錄的PTV的11種血清型基因序列并進(jìn)行比對分析，以AF231769為模板5’端保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，通過優(yōu)化各項(xiàng)反應(yīng)條件，建立了檢測PTV的方法，并對采自廣西各地的豬腹瀉病例糞樣本進(jìn)行PTV檢測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立一種新發(fā)豬疫病病原PTV的檢測方法，并對廣西受檢豬腹瀉病例進(jìn)行PTV感染檢測診斷，為做好廣西PTD的監(jiān)測、預(yù)警及防控提供技術(shù)支持與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒與樣品

豬捷申病毒(PTV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬丁型冠狀病毒(PDCoV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，豬A群輪狀病毒( GARV)、豬C群輪狀病毒( GCRV)陽性樣品由本實(shí)驗(yàn)室保存。病豬腹瀉糞便臨床樣品采自廣西各地養(yǎng)豬場。

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒購自Axygen生物科技有限公司；2×F8 Fastlong PCR MasterMix購自北京艾德萊生物科技公司；DNA Gel Extraction Kit、DL2000 DNA Marker、pMD18-T Vector、BamHⅠ、HindⅢ均購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；E.coliDH5α菌種，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上登錄的PTV全基因序列，利用Primer Premier6.0 軟件以AF231769為模板在5’端保守區(qū)設(shè)計(jì)一對特異性引物PTV-F/PTV-R,PTV上游引物PTV-F: GACCTGCTCTGGCGCGA, PTV下游引物PTV-R: CCCTGTCAGGCAGCACA, PCR擴(kuò)增目的片段大小為202 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 樣品的處理及病毒RNA/DNA的提取

用PBS將采集的腹瀉糞便制成10 %的懸液，渦旋震蕩后，4 ℃，10 000 r/min 離心 10 min 取上清液，直接進(jìn)行RNA/DNA的提取或-20 ℃保存?zhèn)溆谩０凑詹《净蚪MDNA/RNA快速抽提試劑盒使用說明書對PTV、PEDV、PRV、PRRSV、CSFV、TGEV、GARV、GCRV、PDCoV細(xì)胞毒病毒液及腸道粘液、糞便上清進(jìn)行 DNA/RNA提取,所提取RNA直接進(jìn)行RT。

1.5 RT-PCR及退火溫度的摸索

RT合成cDNA，按照RT試劑盒說明，采用20 μl體系：RNA模板14 μl，5×Prime Script TM緩沖液 4 μl，RT Enzyme Mix 1.0 μl，RT引物Oligo18T 1.0 μl，按以下條件進(jìn)行RT反應(yīng): 42 ℃ 40 min，12 ℃保存。PCR反應(yīng)體系25 μl，滅菌水9 μl，2×F8 Fastlong PCR MasterMix 12.5 μl，25 μmol/L PTV上下游引物各0.5 μl，模板2.5 μl。按照下列程序進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性 2 min 30 s；94 ℃變性 10s，58 ℃ 復(fù)性15 s，72 ℃延伸10 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物10 μl于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳并觀察結(jié)果。在其他反應(yīng)成分和反應(yīng)條件不變的情況下對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化摸索，設(shè)置50～60 ℃退火溫度進(jìn)行PCR以確定最佳退火溫度。

1.6 特異性試驗(yàn)

提取PTV、PEDV、PRV、PRRSV、CSFV、TGEV、GARV、GCRV、PDCoV病毒核酸，按照1.5確定的反應(yīng)液體系及退火溫度對本研究建立的RT-PCR方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將PTV PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化后，克隆至pMD18-T vector中，并轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，取80 μl菌液均勻地涂布于LA平板上，16～18 h后挑選陽性菌落進(jìn)LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒并酶切鑒定正確后，將陽性菌液送往上海生物工程有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對確定為PTV特異性片段。另外，抽提臨床樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用NanoDrop2000測量陽性質(zhì)粒濃度或核酸模板濃度，并做10倍梯度稀釋，以各稀釋度的質(zhì)?；蚝怂崮０遄鳛镻CR模板，在同樣條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，測定所建立的RT-PCR診斷方法的敏感性。

1.8 PTV RT-PCR的臨床應(yīng)用

應(yīng)用建立的PTV RT-PCR方法，對2018年3月-2019年4月從廣西各地豬場采集的235份病豬腹瀉糞便樣品進(jìn)行PTV感染檢測。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000 (DNA Marker DL2000)；1：50 ℃；2： 51 ℃；3：52 ℃；4：53 ℃；5：54 ℃；6：55 ℃；7：56 ℃；8：57 ℃；9：58 ℃；10：59 ℃；11：60 ℃圖1 RT-PCR退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperature of the RT-PCR

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：豬捷申病毒；2：ddH2O；3：豬流行性腹瀉病毒；4：豬偽狂犬病病毒；5：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；6：豬瘟病毒；7：豬傳染性胃腸炎病毒；8：豬A群輪狀病毒；9：豬C群輪狀病毒；10：豬丁型冠狀病毒M:DNA Marker DL2000;1:Porcine teschovirus;2:ddH2O;3:Porcine epidemic diarrhea virus;4. Porcine pseudorabies virus;5:Porcine reproductive and respiratory syndrome virus;6:Classical swinefever virus;7:Porcine transmissible gastroenteritis virus;8:Group A porcine rotavirus;9:Group C porcine rotavirus;10. Porcine deltacoronavirus圖2 RT-PCR特異性試驗(yàn)Fig.2 Specificity test of the RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳退火溫度

以cDNA為模板，在其他反應(yīng)成分和反應(yīng)條件不變的情況下設(shè)置不同的退火溫度進(jìn)行PCR，結(jié)果顯示，退火溫度從50～60 ℃，目的片段大小為202 bp(圖1)，隨著退火溫度的升高，PCR擴(kuò)增目的基因片段特異性越強(qiáng)，最終確定本檢測方法的最佳退火溫度設(shè)為58 ℃。

2.2 RT-PCR方法的特異性

本研究建立的RT-PCR檢測方法能特異地檢測出豬捷申病毒目的條帶，而對其他病毒的檢測結(jié)果均無條帶(圖2)。表明所建立的方法具有很好的特異性。

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)測定pMD18-T-PTV質(zhì)粒的濃度為116 ng/μl,PTV臨床樣品核酸的濃度為1215 ng/μl， 質(zhì)粒或核酸進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，然后按照建立的RT-PCR檢測方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，該RT-PCR檢測方法對PTV質(zhì)粒模板的檢測極限為1.16 pg/μl，對PTV核酸模板的檢測極限為12.15 pg/μl(圖3)。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～7：pMD18-T-PTV濃度分別為116 ng/μl，11.6 ng/μl，1.16 ng/μl，116pg/μl，11.6 pg/μl, 1.16 pg/μl,0.116 pg/μlM:DNA Marker DL2000; 1-7:The concentrations of pMD18-T-PTV, 116 ng/μl，11.6 ng/μl，1.16 ng/μl，116 pg/μl，11.6 pg/μl, 1.16 pg/μl,0.116 pg/μl, respectively

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～7： PTV cDNA濃度分別為1215 ng/μl，121.5 ng/μl，12.15 ng/μl，1.215 ng /μl，121.5 pg/μl, 12.15 pg/μl,1.215 pg/μlM:DNA Marker DL2000; 1-7:The concentrations of PTV cDNA, 1215 ng/μl，121.5 ng/μl，12.15 ng/μl，1.215 ng /μl，121.5 pg/μl, 12.15 pg/μl,1.215 pg/μl, respectively圖3 RT-PCR敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity test of the RT-PCR

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～14：臨床樣品M:DNA Marker DL2000; 1-14:Clinical samples圖4 RT-PCR臨床檢測結(jié)果Fig.4 The RT-PCR test results of clinical samples

2.4 臨床樣品檢測情況

用建立的PTV RT-PCR方法檢測2018年3月至2019年4月從廣西各地規(guī)?；i場采集的235份病豬腹瀉糞便,PTV陽性為24份，陽性率為10.21 %。部分臨床樣品RT-PCR檢測結(jié)果見圖4。

3 討 論

作為一種新發(fā)豬疫病，PTD越來越受到受到業(yè)界的研究關(guān)注。前人研究業(yè)已表明，PTV呈廣泛的隱性感染狀態(tài)，且對外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，可以在豬舍中長期存在，該病毒和PCV2共同感染可以引起斷奶仔豬的多系統(tǒng)衰竭綜合征[17]，并且易與PRRSV、PRV、PPV、FMDV、CSFV等混合感染，從而引起感染豬群出現(xiàn)更嚴(yán)重與復(fù)雜的臨床癥狀[18]。PTV的血清型眾多，不同血清型引起的致病性有所不同。馮力等用PTV Swine/CH/IMH/03株 (PTV-1型) 接種3頭仔豬均發(fā)病，實(shí)驗(yàn)豬出現(xiàn)腹瀉，神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，死亡[19]。張曉杰等用PTV HB株(PTV-8型)接種SPF仔豬出現(xiàn)體溫升高、腹瀉，排黃色水樣稀便等狀況[14]。說明PTD也是一種不容忽視的新發(fā)豬疫病，養(yǎng)豬人對PTD應(yīng)引起重視，加強(qiáng)監(jiān)測與防控。

劉芹防等[20]對黑龍江、天津、山東、河南等地區(qū)臨床豬血清樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果陽性率達(dá)55. 8 %。對PTV的檢測以往主要是采取傳統(tǒng)的病毒分離、間接免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法。病毒分離可靠，但費(fèi)時費(fèi)力；免疫學(xué)試驗(yàn)雖然敏感，但容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。而分子生物學(xué)檢測方法，具有特異性強(qiáng)、耗時短等優(yōu)點(diǎn)，但其中熒光定量PCR方法成本較高，而常規(guī)RT-PCR方法成本相對較低，更適合當(dāng)前基層實(shí)際，更利于推廣應(yīng)用。本研究首次在廣西受檢豬群檢測到PTV，表明廣西豬群已存在新發(fā)豬疫病PTD，養(yǎng)豬人應(yīng)予以警惕，對PTD加強(qiáng)監(jiān)測，做好PTD防控預(yù)案。本研究對廣西PTV地方流行毒株進(jìn)行分離鑒定、病毒遺傳進(jìn)化分析、生物學(xué)特性、致病特性等進(jìn)行深入研究，積累PTV研究資料，為有效防控廣西PTD提供科學(xué)依據(jù)。本研究所建立的方法，可PTV的有效防控提供有力的檢測監(jiān)測技術(shù)支持。

4 結(jié) 論

建立的快速檢測PTV的RT-PCR方法，可在2.5 h內(nèi)完成擴(kuò)增檢測，具有較高的敏感性和特異性，適合應(yīng)用于當(dāng)前基層對于PTV檢測監(jiān)測，用該方法首次在廣西受檢豬群檢測到PTV，表明廣西豬群已存在新發(fā)豬疫病PTD。