張 旭，周 毅，羅永巨,，張婧怡，肖 俊，郭忠寶，鐘 歡，唐瞻楊，*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021)

【研究意義】羅非魚(Oreochromisspp.)原產(chǎn)自非洲，鱸形目麗魚科(Cichlidae)羅非魚屬(Oreochromis)，在世界范圍內(nèi)被廣泛養(yǎng)殖[1-2]。羅非魚生長快、養(yǎng)殖周期短、適應(yīng)性強，目前是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一。隨著苗種的繁育[3]、疾病防控等技術(shù)以及養(yǎng)殖設(shè)施的不斷優(yōu)化，使得養(yǎng)殖羅非魚的規(guī)模不斷上升。光周期是魚類生存必需的環(huán)境因子之一，影響著魚類的生長、生殖、代謝等活動[4-5]，魚類除眼睛外還可以通過大腦松果體中的光受體接收光信息的輸入[6]。但是光信息被魚類中樞系統(tǒng)內(nèi)部接收后，其傳導(dǎo)的途徑和方式目前還不完全清楚[7]。對不同光周期條件下的尼羅羅非魚腦組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，可發(fā)掘尼羅羅非魚響應(yīng)光周期變化的重要功能基因，為進一步研究尼羅羅非魚及其他硬骨魚類響應(yīng)光周期變化的分子機制提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】光周期對不同種類魚的生長發(fā)育，身體色素變化，性成熟以及繁殖的影響都已有相關(guān)研究[8-9]。Biswas和Takeuchi[10]報道，在短光照周期條件下羅非魚仔魚生長發(fā)育遲緩其節(jié)律機制不能建立；McConnell[11]研究結(jié)果表明羅非魚在自然環(huán)境中對光照周期表現(xiàn)出一定的敏感性；Rad等[12]認(rèn)為長光照周期條件可以改善羅非魚的攝食率，延緩其性腺發(fā)育。作為目前基因組學(xué)研究過程中應(yīng)用最廣泛的測序技術(shù)，新一代高通量測序RNA-seq技術(shù)具有高通量、耗時短、測序片段長、成本低等優(yōu)點[13-14]。隨著高通量測序技術(shù)的不斷優(yōu)化，在水產(chǎn)動物各個領(lǐng)域開展了大量的轉(zhuǎn)錄組測序研究。陳阿琴等[15]以日本牙鲆為研究對象，利用新一代高通量測序RNA-seq技術(shù)研究了尾部神經(jīng)分泌系統(tǒng)在不同光周期條件下的基因表達變化情況；姜宇等[16]利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對富鐵環(huán)境中生存的斑馬魚和野生型的斑馬魚進行測序,比較篩選出富鐵環(huán)境影響的成骨通道，通過在體以及離體實驗證實富鐵環(huán)境對這些通道的作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前對羅非魚的研究主要集中在養(yǎng)殖模式、病害防治[17]、營養(yǎng)特質(zhì)[18-19]等方面，對其適應(yīng)環(huán)境變化的功能基因信息的研究比較匱乏。季節(jié)變化帶來的主要影響之一是光周期的改變，目前對尼羅羅非魚腦組織轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)不同光周期變化的研究尚少見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用RNA-seq測序技術(shù)對不同光周期條件下的尼羅羅非魚腦組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析后獲得尼羅羅非魚腦組織中響應(yīng)光周期變化的差異表達基因序列及注釋信息，為今后研究羅非魚的功能基因組學(xué)提供了基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試尼羅羅非魚來自廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院國家級廣西南寧羅非魚良種場，體質(zhì)量為(30.1±4.24)g，健康有活力無病毒感染。正式試驗開始前在溫度為(28±0.5)℃，pH 8，光照強度為1000 lx，光照條件為12 h光照12 h黑暗(12L∶12D)的環(huán)境中暫養(yǎng)2周。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗魚處理及樣品采集 設(shè)3個光照周期，24L∶0D和0L∶24D為試驗組12L∶12D為對照組，光照強度為1000 lx。挑選健康有活力的90尾實驗魚隨機平均分配到設(shè)置好的光周期條件下飼養(yǎng)30 d后進行取樣。養(yǎng)殖期間魚體健康無染病情況，取樣時在每組30尾魚中隨機處理3條，先對魚進行麻醉然后迅速在冰盤上取出腦組織置于液氮中保存。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫制備 取冷凍的羅非魚腦組織按照Biozol RNA miniprep kit (BIOMIGA)操作說明進行總RNA的提取，DNaseI消化去除樣品中殘留基因組DNA。用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA是否存在降解和污染情況。通過NanoPhotometer分光光度計(IMPLEN，CA，USA)來檢測提取總RNA的純度是否滿足實驗要求。利用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)(Agilent Technologies，CA，USA)的RNA Nano 6000 Assay Kit來檢測提取RNA的完整性。使用Qubit 2.0 Flurometer(Life Technologies，CA，USA)中的Qubit RNA測定試劑盒測量提取總RNA的濃度。將同一光周期處理的羅非魚腦組織總RNA等量混合。將樣品的mRNA通過帶有Oligo(dT)的磁珠進行富集，使用Fragmentation Buffer隨機打斷目的mRNA，以目的mRNA為模板六堿基隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成第1條cDNA鏈。然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I進行第2條cDNA鏈合成，使用AMPure XP beads對cDNA產(chǎn)物純化。純化后的cDNA進行末端修復(fù)及加A尾連接測序接頭，利用AMPure XP beads進行cDNA片段大小的選擇后通過PCR富集得到cDNA文庫。通過使用IlluminaHiSeq平臺對建好的文庫進行測序。由百邁客生物科技有限公司對實驗樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序和建庫。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理與分析 對測序獲得的原始數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)整理，包括去除含有接頭的Reads；去除N(不確定的堿基)的比例大于10 %的Reads；去除質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整條Read的50 %以上的Reads。通過上述一系列的質(zhì)量控制篩選之后得到高質(zhì)量的Clean Data。然后利用TopHat2[20]將獲得的Clean Reads與羅非魚參考基因組(參考基因組下載地址見：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)進行基因序列比對，以便獲得參考基因組上的位置信號和檢測樣品的特有序列特征信息。通過某一轉(zhuǎn)錄本上比對的片段數(shù)目即雙端Reads數(shù)目、轉(zhuǎn)錄本上的比對總片段數(shù)(以106為單位)和轉(zhuǎn)錄本的長度(以103個堿基為單位)來計算某一基因的表達量，具體方法為FPKM法[21]計算每個基因在不同樣本中的表達量。

表1 不同光周期條件下羅非魚腦組織文庫測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對結(jié)果

注：Total Reads：Clean Reads數(shù)目及其百分比(100 %)；mapped Reads：比對到參考基因組上的Reads數(shù)目及在Clean Reads 中占的百分比。

Note： Total Reads: the number and percentage of Clean Reads (100 %);Mapped Reads: The number of Reads mapped to the reference genome and the percentage of Clean Reads.

1.2.4 基因差異表達分析 參照DESeq[22]測序差異基因檢測方法，通過比較不同光周期條件下羅非魚腦組織中表達的所有基因，篩選出差異表達的基因(DEGs)。利用錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate，F(xiàn)DR)確定差異顯著性P-value的域值。同時根據(jù)基因的表達量來計算該基因在不同光周期條件下的差異表達倍數(shù)。將Fold Change≥2且FDR<0.01作為差異表達基因檢測過程中的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 基因功能注釋及富集分析 對得到的所有差異基因使用Blast2 GO軟件(默認(rèn)參數(shù))進行GO注釋信息，對所有的差異基因用WEGO軟件進行GO功能分類統(tǒng)計。GO注釋系統(tǒng)是一個有向無環(huán)圖包括3個主要分支，即：生物學(xué)過程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function)和細胞組分(Cellular Component)。把基因序列通過BLAST軟件比對到KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫進行注釋，然后對生物體代謝網(wǎng)絡(luò)進行研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 尼羅羅非魚腦組織序列分析

2.1.1 序列質(zhì)量評價 羅非魚腦組織轉(zhuǎn)錄組測序共獲得52.21Gb Clean Data。文庫中各種reads所占比例分布情況見表1，其中12L∶12D、24L∶0D和0L∶24D條件下腦組織Clean reads分別有61 410 946、55 524 504和58 855 762條。不同光周期處理后可以比對到羅非魚基因組上的reads分別為44 208 729、40 615 782和42 545 434條，比對到羅非魚基因組上的reads數(shù)占總Clean Reads的比例分別達到71.99 %、73.15 %、72.29 %(表1)。

2.1.2 測序飽和度分析 為了評估得到的數(shù)據(jù)是否滿足后續(xù)分析，將測序得到的基因數(shù)進行飽和度檢測(圖1)。檢測結(jié)果顯示：12L∶12D、24L∶0D和0L∶24D 3個光周期條件下的飽和度分別相似，且定位到參考基因組上的Reads數(shù)占總定位Reads數(shù)的百分比不再增加，說明腦組織基因測序數(shù)量趨于飽和可以滿足后續(xù)的分析。

2.2 差異表達基因

通過對3個文庫之間基因差異表達情況進行兩兩比較分析，獲得了不同光周期條件下腦組織的基因差異表達的基本信息。24L∶0D與12L∶12D 2個文庫比較存在279個差異表達基因，其中161個基因上調(diào)、118個基因下調(diào)；0L∶24D與12L∶12D文庫比較存在304個差異表達基因，其中193個上調(diào)基因、111個下調(diào)基因；24L∶0D與0L∶24D文庫相比較存在383個差異表達基因，其中253個上調(diào)、130個下調(diào)(表2)。

圖中是隨機抽取 10 %、20 %、30 %……90 %的總體測序數(shù)據(jù)單獨進行基因定量分析的結(jié)果；橫坐標(biāo)代表抽取數(shù)據(jù)定位到基因組上的 Reads數(shù)占總定位的reads數(shù)的百分比，縱坐標(biāo)代表所有抽樣結(jié)果中表達量差距小于15 %的Gene在各個FPKM 范圍的百分比。不同顏色代表不同的基因表達量范圍In the figure, 10 %, 20 % and 30 % are randomly selected... 90 % of the total sequencing data were the results of gene quantitative analysis alone.The x-coordinate represents the percentage of Reads extracted from the data and localized to the genome in the total Reads.The ordinate represents the percentage of Gene in each FPKM range where the expression gap is less than 15 % in all sample results.Different colors represent different gene expression ranges圖1 不同光周期條件下尼羅羅非魚腦組織序列飽和度分析Fig.1 Sequence saturation analysis of brain tissue of Nile tilapia under different photoperiod conditions

表2 差異表達基因數(shù)目統(tǒng)計

2.3 差異表達基因GO功能分類

對DEGs基因進行GO功能分類分析將0L∶24D、12L∶2D和24L∶0D文庫中的差異表達基因歸類到GO 3大分支(生物過程、細胞組分和分子功能)的58個類別中(圖2)。在生物過程類中，與生物過程(cellular process)、單生物過程(single-organism process)、代謝過程(metabolic process)相關(guān)的基因富集表達較多；在細胞組分一欄中，與細胞組成(cell，cell part)和細胞器組成(organelle，organelle part)相關(guān)的基因富集表達較多；在分子功能一欄中與結(jié)合功能(binding)和催化活性(catalyticactivity)相關(guān)的基因富集表達比較多。另外在24L∶0D和12L∶12D文庫比較中發(fā)現(xiàn)，在細胞凝集(cell aggregation)和胞外基質(zhì)(extracellular matrix part)中存在差異表達基因富集現(xiàn)象；在0L∶24D和12L∶12D文庫比較中發(fā)現(xiàn)差異表達基因富集現(xiàn)象在細胞凋亡過程(cell killing)中存在；而細胞凋亡過程(cell killing)、細胞凝集(cell aggregation)和胞外基質(zhì)(extracellular matrix part)在0L∶24D和24L∶0D的文庫比較中發(fā)現(xiàn)存在差異表達基因富集現(xiàn)象。

2.4 KEGG Pathway分析

為進一步深入發(fā)掘不同光周期處理條件下差異表達基因的功能，將不同光周期處理條件下的差異表達基因進行KEGG富集分析。將文庫中的差異表達基因定位到143個特定的KEGG代謝途徑，在顯著性富集排名前20的通路中挑選了顯著性最高的前3個通路進行結(jié)果展示(表3)。不同光周期條件下的差異表達基因在單純皰疹感染(Herpes simplex infection)、ECM-受體相互作用(ECM-receptor interaction)、細胞因子-細胞因子與受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、腸道IgA生成免疫網(wǎng)絡(luò)(Intestinal immune network for IgA production)、細胞粘附分子(CAMs)、Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)等信號通路上出現(xiàn)顯著性富集，其中在單純皰疹感染號通路中的基因富集數(shù)量最多。

將單純皰疹感染(Herpes simplex infection)信號通路和Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)中的表達差異基因列于表4。24L∶0D試驗組與對照組相比較，單純皰疹感染信號通路中有13個差異表達基因，其中7個基因表達量上調(diào)，6個基因表達量下調(diào)，Wnt信號通路中有2個差異表達基因，表達量均上調(diào)。0L∶24D試驗組與對照組相比較，單純皰疹感染通路中有14個差異表達基因，其中9個基因表達量上調(diào)，5個基因表達量下調(diào)，Wnt信號通路中有2個差異表達基因，其中表達量上調(diào)和下調(diào)的基因各有1個。在0L∶24D和24L∶0D試驗組，Clock基因表達量均上調(diào)；Sox17基因表達量在24L∶0D試驗組上調(diào)，在0L∶24D試驗組下調(diào)；fosl1基因表達量在24L∶0D試驗組上調(diào)，在0L∶24D試驗組沒有變化。

3 討 論

近些年來，在水產(chǎn)動物研究中轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，該技術(shù)在免疫應(yīng)答反應(yīng)、生長發(fā)育過程、生物進化研究和毒理學(xué)等方面取得了大量的研究進展[23]。本研究通過RNA-seq技術(shù)對0L∶24D、12L∶12D和24L∶0D 3個光周期條件下尼羅羅非魚腦組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析得到大量數(shù)據(jù)，豐富了羅非魚的基因組資源。不同光周期條件下的差異表達基因在單純皰疹感染(Herpes simplex infection)、ECM-受體相互作用(ECM-receptor interaction)、Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)等信號通路上出現(xiàn)顯著性富集。Wnt信號通路作為高度保守的信號通路，在機體生長發(fā)育和代謝活動等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[24]。Sox17基因是Sox基因家族的一員，該基因含有一個保守HMG(HighMobilityGroup)盒，編碼產(chǎn)物能夠特異性地識別和結(jié)合某DNA序列，使目標(biāo)DNA序列發(fā)生彎曲，是一類不可或缺的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[25-26]。其在胚胎干細胞發(fā)育[27]、細胞分化調(diào)控[28]等方面發(fā)揮了極大的作用。本研究與對照組比較發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)中的Sox17基因表達量在長光照周期24L∶0D條件上調(diào)，在短光照周期0L∶24D條件下調(diào)，表明羅非魚腦組織中的Sox17基因表達受光照周期的影響。經(jīng)過分析我們推測長光照周期條件下Sox17基因表達量上調(diào)促進尼羅羅非魚的細胞分化和組織細胞更新?lián)Q代等一系列生命活動，對尼羅羅非魚的生長、發(fā)育起促進作用。相反短光照周期條件下Sox17基因表達量下調(diào)，對尼羅羅非魚的生長發(fā)育有抑制作用。但是目前對光周期影響羅非魚腦組織中Sox17基因表達的調(diào)控機理以及Sox17基因?qū)α_非魚生命活動的調(diào)控機制的研究比較匱乏還有待深入研究。

橫軸是GO種類；縱軸左邊是基因數(shù)量百分比；右邊是基因數(shù)量。A:24L∶0D/12L∶12D;B:0L∶24D/12L∶12D;C:0L∶24D/24L∶0DOn the horizontal axis are the GO species; On the left vertical axis is the percentage of genes; On the right is the number of genes.A:24L∶0D/12L∶12D;B:0L∶24D/12L∶12D;C:0L∶24D/24L∶0D圖2 不同光周期條件下差異表達基因GO注釋分類統(tǒng)計圖Fig.2 GO annotation classification of differentially expressed genes under different photoperiod conditions

表3 差異表達基因的KEGG富集結(jié)果

表4 不同光周期條件下Herpes simplex infection和Wnt signaling pathway信號通路差異表達基因情況

續(xù)表4 Continued table 4

通路名Pathway基因IDGene ID24L∶0D/12L∶12D0L∶24D/12L∶12D基因名稱 Gene nameLOC100702693▁▁upHLA class II histocompatibility antigen, DR al-pha chain-like isoform X1Tilapia_newGene_5403▁▁upcellular tumor antigen p53-like isoform X1per1▁▁downperiod circadian protein homolog 1-like isoform X1Wnt signaling pathwaysox17updowntranscription factor SOX-17-likefosl1up▁▁fos-related antigen 2-like isoform X2 Tilapia_newGene_5403▁▁upcellular tumor antigen p53-like isoform X1

在季節(jié)變化的自然規(guī)律下，溫度與光周期發(fā)生緊密聯(lián)合的改變，是動物代謝能力調(diào)控的兩個重要因素[29]。研究發(fā)現(xiàn)，光周期發(fā)生變化導(dǎo)致尼羅羅非魚生物鐘改變，單純皰疹感染信號通路(Herpes simplex infection)中的生物鐘基因Clock在短光照周期和長光照周期條件下表達量均發(fā)生上調(diào)。生物鐘(Circadian Clocks)是生物體適應(yīng)地球長期周期性變化的光照和溫度等環(huán)境因素逐漸演化形成的內(nèi)在自主計時機制[30]。在生物體的生殖、生長發(fā)育、免疫以及各種基本生命活動過程中，生物鐘都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Kennaway[31]認(rèn)為Clock發(fā)生突變后小鼠的發(fā)情周期被延長，在黑暗環(huán)境中發(fā)情周期可以一直被持續(xù)延長，得出Clock基因?qū)π∈蠓敝衬芰τ兄匾饔?。Fred等[32]在以小鼠為研究對象中發(fā)現(xiàn)小鼠Clock基因被敲除后表現(xiàn)出生物鐘節(jié)律紊亂、食欲提高、過度肥胖等現(xiàn)象，并且患高脂高糖血癥的幾率增加。本研究推測光周期條件改變導(dǎo)致尼羅羅非魚生物鐘發(fā)生紊亂，生物鐘基因Clock和晝夜節(jié)律基因PER在不同處理組出現(xiàn)差異性表達，引起尼羅羅非魚在攝食率、性腺發(fā)育等生物節(jié)律方面的變化，從而對尼羅羅非魚的生命活動產(chǎn)生影響。目前對生物鐘Clock的研究主要集中在斑馬魚[33]等模式生物中，在羅非魚上鮮有報道，不同光周期對羅非魚生物鐘的影響機制有待進一步研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)蛋白激酶R基因(PKR)、生物節(jié)律相關(guān)基因(BMALI)等基因在不同光周期條件下被證實發(fā)生差異表達，涉及動物免疫功能、動物節(jié)律等方面。本研究采用高通量測序技術(shù)分析比較了不同光周期條件下羅非魚腦組織中相關(guān)功能基因的表達，為研究環(huán)境因子對羅非魚免疫應(yīng)答、節(jié)律等相關(guān)基因及信號通路的篩選提供參考，同時為進一步研究硬骨魚類中樞神經(jīng)系統(tǒng)響應(yīng)光周期變化的應(yīng)答機制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

4 結(jié) 論

通過分析比較尼羅羅非魚腦組織在不同光周期處理條件下的轉(zhuǎn)錄組序列，發(fā)現(xiàn)光周期變化影響尼羅羅非魚腦組織基因表達水平，表達差異基因主要富集在單純皰疹感染(Herpes simplex infection)、細胞因子-細胞因子與受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)等信號通路，該分析結(jié)果不僅揭示了羅非魚腦組織在響應(yīng)光周期變化時的分子機制，也為進一步探索硬骨魚類光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制提供了理論依據(jù)。