年 偉，鄧 偉，張錦文，史勝利，呂永剛，葉昌榮，徐雨然，谷安宇，安 華，呂 瑩，李小林

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】花青素 (Anthocyanidin) 是維管植物最為重要的水溶性色素，屬于一大類稱之為黃酮類化合物的次級代謝產(chǎn)物，基本結(jié)構(gòu)是由C6-C3-C615個碳原子構(gòu)成的2-苯基苯并吡喃 (2-phenyl-benzopyrylium)，即花色基元陽離子 (圖1a)，其B環(huán)3'及5'位置不同的羥基化及甲氧基化形成了6種最常見的花青素 (圖1b)：天竺葵素 (Pelargonidin，Pg)、矢車菊素 (Cyanidin, Cy)、飛燕草素 (Delphinidin，De)、芍藥素 (Peonidin，Pn)、矮牽牛素 (Petunidin，Pt) 及錦葵素 (Malvidin，Ma)?；ㄉ?(Anthocyanin) 是花青素的糖苷衍生物，由于糖苷種類、結(jié)合部位及數(shù)目的不同，種類達(dá)500多種[1]。除賦予多種水果、蔬菜、谷物及花瓣以紅色、紫色和藍(lán)色外，花色苷在植物的生殖機(jī)制如授粉、種子傳播以及抵抗逆境、拒食保護(hù)等方面發(fā)揮著重要的作用。例如，能夠減輕紫外光 (UV-B) 對植物的傷害，抵抗干旱和鹽害[2]，響應(yīng)水分脅迫和熱脅迫；棉花葉片中的矢車菊素-3-葡糖苷 (Cyd 3-glu) 對煙草夜蛾 (HeliothisvirescensF.) 幼蟲的生長有特別的抑制作用[3]。在食品工業(yè)中，花色苷除了能作為純天然的食品添加劑給各種食品染色之外，還可鑒別使用了何種葡萄品種釀造紅葡萄酒以及是否添加了外源性色素[4]。花色苷對人的健康有重要的營養(yǎng)價值和功能特性，如增強細(xì)胞的抗氧化能力從而防止低密度脂蛋白 (Low-Density Lipoprotein，LDL) 的氧化、預(yù)防心血管疾病、顯著降低紅細(xì)胞中過量的活性氧、抗炎及抗癌活性、控制糖尿病等[5]。【前人研究進(jìn)展】黑米富含花色苷，在亞洲許多國家有著悠久的種植歷史，所含花色苷主要有4種：矢車菊素-3-葡糖苷、芍藥素-3-葡糖苷 (Pn-3-glu)、矢車菊素-3,5-二葡糖苷 (Cy-3,5-diglucoside) 和矢車菊素-3-蕓香糖苷 (cy-3-rutinoside)，分別占91.01 %、7.13 %、0.92 %和0.94 %[6]，且絕大部分集中于只占籽粒重量8 %～10 %的糠層，該層含量超過其總量的95 %，只有不到5 %分布于胚部[7]。糙米籽粒大小與諸多碾米品質(zhì)、外觀品質(zhì)及物理化學(xué)特性顯著相關(guān)[8]，某些營養(yǎng)成分的含量與粒度的關(guān)系也有報道，如較厚的糙米含有更高濃度的生育酚、生育三烯酚和γ-谷維素[9]；黃酮含量與籽粒長度和長寬比正相關(guān)，與百粒重呈負(fù)相關(guān)[10]；較薄的籽粒含有較高含量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、纖維和灰分[11]。【本研究切入點】黑米粒度與花色苷含量的相互關(guān)系還未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】眾所周知，重量相同的顆粒物，三維尺寸越小，表面積越大。加之黑米花色苷主要分布于糠層，由此產(chǎn)生了疑問，粒度不同但重量相同的黑米，花色苷含量是否也大致相等呢？還是顆粒較小的黑米含有更多的花色苷？另一方面，花色苷的萃取和純化不僅耗時，而且對環(huán)境條件的要求較高，能否依據(jù)籽粒大小和重量建立模型而快速有效地對黑米花色苷含量進(jìn)行評估呢？

圖1 花色基元陽離子(a)及花青素(b)的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of 2-phenyl-benzopyrylium (a) and Anthocyanidin (b)

1 材料與方法

1.1 材料

云谷1號為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所選育的粳型黑米 (OryzasativaL. ssp.japonica)。2016年10月收獲于云南省曲靖市羅平縣 (24°51′N, 104°17′E, 1500 m a.s.l.)，自然干燥至水分含量13 %，-10 ℃避光保存。樣品脫殼后使用LA-LS種子分級機(jī) (Westrup，DK)分為6個厚度區(qū)間 (組)：<1.50 mm、1.50～1.70 mm、1.70～1.80 mm、1.80～1.90 mm、1.90～2.00 mm、>2.00 mm，隨機(jī)測量各區(qū)間100粒的粒長、粒寬、粒厚和粒重，重復(fù)3次。實驗中使用了Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO, USA)的高效液相色譜級甲醇 (MeOH)，Waters (Milford, MA, USA) C18層析柱(6cc, 500mg silica sorbent)，Whatman no.1定性濾紙(110 mm，圓形)，以及分析純氯化氫 (HCl)、氯化鉀(KCl)、乙酸鈉 (CH3CO2Na·3H2O)、乙酸乙酯 (Ethyl Acetate)。酸化甲醇和酸化去離子水含0.01 % (v/v) HCl。

1.2 花色苷的萃取和純化

花色苷的萃取和純化參照Rodriguez和Wrolstad[12]的方法進(jìn)行并作適當(dāng)改動。精確稱量1 g樣品研磨成粉，加入50 mL酸化甲醇常溫下避光浸泡1 h。重復(fù)萃取3次后真空抽吸過濾懸浮液，40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇后將色素溶于酸化去離子水。水溶物經(jīng)C18柱吸附后，分別用12 mL酸化去離子水和乙酸乙酯洗去未被吸附的化合物 (糖類、酸類) 以及吸附的多酚類化合物 (酚酸、黃酮醇) ，最后以酸化甲醇溶解被吸附的色素。再次旋蒸除去甲醇后將色素溶于20 mL酸化去離子水備用。

1.3 測定及計算方法

pH示差法用于測定1.2制備的溶液吸光度值，以公式 (1) 計算總花色苷含量 (Total anthocyanin content, TAC)。

(1)

式中，A=(A512nm-A700nm)pH1.0- (A512nm-A700nm)pH4.5，稀釋樣品的吸光度差值；MW=449.2 g/mol，Cy-3-glu的摩爾質(zhì)量；DF=6，稀釋因子；Vw=20，溶解花色苷的酸化去離子水體積；ε=26 900 L/mol cm，Cy-3-glu的摩爾吸光系數(shù)；1為比色皿光路長度，單位cm?？偦ㄉ蘸勘硎緸镃y-3-glu。實驗中掃描了從240～700 nm波長范圍的吸光度值，最大吸光度波長 (λvis-max) 在512 nm處。

表1 不同厚度區(qū)間籽粒外形、百粒重與總花色苷含量值

注：樣本均值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；粒厚、粒寬、粒長、體積和表面積n=300，百粒重和TAC n=3；同列不同字母表示差異顯著 (P=0.05，SNK多重比較)。

Note： Data of samples express as mean± SD. Thickness, Width, Length, Volume and Surface area n=300, 100-grain weight and TAC n=3. Different letters in the same column are significantly different (P=0.05, Student-Newman-Keul's multiple range test).

單粒黑米籽粒的體積 (V) 和表面積 (S) 依據(jù)Jain和Bal的方法[13]分別以公式 (2) 及公式 (3) 計算：

(2)

(3)

1.4 分析方法

描述統(tǒng)計、Student-Newman-Keuls多重比較、兩兩相關(guān)分析和共線性診斷使用SPSS v22.0 (IBM, USA)軟件完成，偏最小二乘 (Partial least squares, PLS) 分析及回歸使用SIMCA v14.1.0 (Umetrics, Sweden)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒外形、百粒重與總花色苷含量

云谷1號籽粒寬度、長度、單粒體積和表面積、百粒重以及TAC隨籽粒厚度的增加而增加，各區(qū)間的厚度、寬度、體積和表面積差異顯著；1、2組間，2、3組間粒長差異不顯著；百粒重除5、6組間差異不顯著外，其它各組間差異均顯著；TAC 2組與3組，3～6組的組間差異不顯著 (表1)。

所有厚度區(qū)間的云谷1號TAC平均為97.2～193.8 mg/100g。值得注意的是，厚度小于1.70 mm的籽粒相對百分比9.6 % (第1～2組)；超過1.70 mm后 (第3～6組，相對百分比90.4 %)，TAC差異不顯著，但與之相應(yīng)的粒厚、粒寬和粒長差異卻是顯著的，平均TAC高出第1、2組48.9 %。盡管單個籽粒的體積和表面積隨著三維值的增加而增加，但就同等重量的樣品來看，因為粒數(shù)的不同其總的體積和表面積會有不同，粒度較小的籽粒其總體積和總表面積會更大，顯示盡管粒度較小的籽粒具有更大的表面積，但其充實度低于較大的籽粒。

2.2 粒度、百粒重和TAC之間的相關(guān)性

實驗涉及的幾個參數(shù)與TAC均為正相關(guān)關(guān)系，所有變量中，粒厚與TAC的相關(guān)度最高 (r=0.922)，其次為百粒重 (r=0.911)、粒寬 (r=0.882)，最后是粒長 (r=0.753) (表2)。

表2 各因素間兩兩相關(guān)系數(shù)

注：** 在0.01水平上顯著。

Note： ** is significant at 0.01 probability level.

圖2 t1/t2得分圖 (a) 和權(quán)重圖 (b)Fig.2 PLS t1/t2score plot (a), weight plot (b)

此外，4個變量彼此間具有較高的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.879～0.993 (P< 0.01)，表明4個變量間可能存在多重共線性。方差膨脹因子 (The Variance Inflation Factor, VIF)常被用來診斷多重共線性 (Multicollinearity)，若VIF值高于10，則存在明顯的多重共線性，會顯著地影響參數(shù)估計的穩(wěn)健性。多元線性回歸結(jié)果顯示，VIF值14.0～120.85，回歸系數(shù)中出現(xiàn)了負(fù)值 (粒厚-2.968，粒長-0.519)，這一結(jié)果違背常理，同時表明這四個因子間確實存在多重共線性并影響了回歸結(jié)果。

2.3 PLS分析及回歸

在處理多元變量或者變量間具有共線性響應(yīng)特性時，偏最小二乘 (Partial Least Squares, PLS) 為探究更為復(fù)雜的變量問題以及分析變量數(shù)據(jù)提供了現(xiàn)實可行的方法。以粒厚、粒寬、粒長和百粒重為X變量，TAC為Y變量建立PLS模型，得到2個主成分，分別解釋了99.6 %的X變異 (R2X) 和87.3 %的Y變異 (R2Y)，預(yù)測率為83.6 % (Q2，即“交叉驗證”后的R2) (表3)。

在SIMCA軟件中，t和u可視為從原變量(x，y)提取的新的潛在變量，是原變量在主成分平面投影的向量，最大限度地攜帶了原變量所包含的信息，同時自變量t對因變量u又具有最強的解釋能力。從1/t2得分圖和T2橢圓可以看出(圖2a)，18個樣本點 (3個點為一組，代表某一厚度區(qū)間的3次重復(fù)，如1～3為<1.50 mm的3次重復(fù)) 均分布在橢圓內(nèi)，沒有異常值。1～9 (厚度小于1.80 mm) 的組間差異明顯，占據(jù)了水平方向的左邊；10～18 (厚度大于1.80 mm) 占據(jù)了水平方向的右邊，組間差異不如1～9明顯，組內(nèi)差異也小于1～9。表明當(dāng)厚度超過1.80 mm后，粒度、百粒重和TAC都明顯較高，7～9 (1.70～1.80 mm) 則處于中間過渡態(tài)。

PLS模型的權(quán)重圖 (圖2b) 表明，四個因子均正相關(guān)于應(yīng)答因子TAC，影響力度從大到小依次為粒厚、百粒重、粒寬、粒長。粒厚、百粒重和粒寬3個因子有較強的相關(guān)性，與粒長有一定的相關(guān)性，任何一個因子的變化都會引起其它3個因子發(fā)生變化。從圖2b還可看出，粒厚對百粒重的影響最大，其次是粒寬，最后是粒長。

t/u平面圖常被用來判斷自變量與因變量之間的相關(guān)關(guān)系。t1/u1(圖3a)比t2/u2(圖3b)更具有明顯的線性關(guān)系 (圖3a)，盡管t2/u2也呈現(xiàn)出了一定的線性趨勢，但是樣本點分布較為松散。因此，主成分1已經(jīng)具有足夠的能力解釋原變量的變異 (R2X=0.963)，并且，t1/u1明顯的線性關(guān)系也表明使用主成分1來建立線性模型是合理的。

表3 PLS模型的解釋率和預(yù)測率

注：觀察值 (N)=18，變量 (K)=5 (X=4,Y=1)。

Note： Observations (N)=18, variables (K)=5 (X=4,Y=1).

圖3 t1/u1 (a) 與t2/u2 (b)平面圖Fig.3 t1/u1 (a) and t2/u2

圖4 PLS模型VIP圖 (a) 和響應(yīng)置換圖 (b)Fig.4 The VIP plot (a) and the Permutation plot (b) of the PLS model

加入主成分2以后，粒長的回歸系數(shù)變?yōu)榱素?fù)值 (表4)。結(jié)合PLS模型的權(quán)重圖 (圖2b)，表明主成分2對粒長的影響比主成分1更大，并且與之負(fù)相關(guān)。

基于上述分析，使用第一主成分來建立原始變量回歸方程是可行的：

y=13.121+0.425x1+0.600x2+0.378x3+0.190x4

(4)

回歸方程 (4) 中的y是一個基于原變量并與之線性相關(guān)的新的綜合變量，解釋了原變量78.8 %的變異 (表3)，可視為基于粒度和粒重的云谷1號黑米花色苷含量綜合評估指數(shù)。變量投影重要性 (Variable Influence on Projection, VIP) 用來描述新變量解釋原自變量及原自變量與因變量關(guān)聯(lián)性的重要程度。如果VIP值大于1，表明該變量是“重要”變量；VIP值小于0.5表明該變量是“不重要”的變量；VIP值介于0.5～1之間是灰色區(qū)域，其重要程度依賴于數(shù)據(jù)集的大小。主成分1的VIP值從粒厚1.06，百粒重1.05，粒寬1.01到粒長0.87逐漸遞減 (圖4a)，表明粒厚、百粒重及粒寬在構(gòu)建TAC時均為重要因子，其重要性高于粒長，這一結(jié)果與表2所列結(jié)果一致。

雖然表3已列出了PLS模型的解釋能力和預(yù)測能力，但交叉驗證的一個缺陷是僅評估了模型的解釋能力和預(yù)測能力而沒有考察其統(tǒng)計顯著性[14]。響應(yīng)置換 (Response Permutation)是SIMCA軟件中一個能夠評估PLS模型解釋率 (R2) 和預(yù)測率 (Q2) 顯著性的有用工具。圖4，b顯示了以TAC為應(yīng)答因子的100次置換結(jié)果，模型的R2Y和Q2Y值均大幅度地高于相應(yīng)的置換值，并且R2Y的Y截距為-0.0914 (沒有超過0.3～0.4)，Q2Y的截距為-0.214 (沒有超過0.05)，表明PLS模型是有效的[14]。

表4 PLS模型回歸系數(shù)(P =0.05)

注：** CoeffCS表示原自變量X進(jìn)行了中心化和標(biāo)準(zhǔn)化，因變量Y進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化但沒有中心化。Coeff表示原變量沒有進(jìn)行中心化和標(biāo)準(zhǔn)化，方括號內(nèi)的數(shù)字表示使用主成分1或者同時使用主成分2。

Note： ** CoeffCS means regression coefficients corresponding to the centered and scaledX, and scaled but uncenteredY. Coeff means regression coefficients corresponding to the unscaledXandY. The number in square brackets means comp.1 or 2 components used at the same time.

3 討 論

花色苷和其它化合物(輔色素)的共色作用是植物色彩穩(wěn)定的主要機(jī)理。輔色素通常無色，但是同花青素溶液混合后相互作用產(chǎn)生增色效應(yīng)而導(dǎo)致吸收光譜的紅移[1,15]。另一方面，B環(huán)羥基被糖取代則會引起可見光譜的藍(lán)移效應(yīng)，隨著糖苷數(shù)目的增加，最大吸收峰波長值越來越短。如Cy-3, 5-二糖苷在鹽酸甲醇溶液中于526 nm處有最大吸收峰，3, 3′-二糖苷在519 nm以及3, 5, 3′-三糖苷在518 nm處有最大吸收峰[4]。Jurd和Asen[16]報道了Cy-3-glu在pH 1.0溶液中λvis-max位于510 nm處，但云谷1號花色苷位于512 nm處，共色作用可能對此產(chǎn)生影響。Abdel[17]的實驗結(jié)果顯示基于矢車菊素化合物的λvis-max范圍從512～520 nm。因此，實驗中檢測到的最大可見吸收波長為512 nm是可靠的。

稻穗由許多分支構(gòu)成，含有2種極端類型的籽粒，即強勢粒和弱勢粒，通常由籽粒的重量所決定，與小穗的位置和開花順序有關(guān)。一般情況下，粒重從穗部自上而下遞減，就胚乳細(xì)胞的分裂和籽粒灌漿速率來看，開花較早的強勢小穗比后開花的弱勢小穗更具有優(yōu)勢[18]。換言之，強勢粒和弱勢粒的粒度表現(xiàn)存在著明顯差異，云谷1號粒度的差異在一定程度上也反映了這種現(xiàn)象。粒度是決定谷物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一，并且前已述及，某些營養(yǎng)素濃度與粒度大小有密切聯(lián)系，既有正相關(guān)也有負(fù)相關(guān)，不同粒度云谷1號糙米籽粒TAC的差異可被視為強、弱勢粒TAC的差異。碳代謝過程中，糖的累積對黑米淀粉和花色苷的生物合成發(fā)揮著重要作用[19-20]，營養(yǎng)物質(zhì)的再活化會影響淀粉合成，進(jìn)而在谷物花色苷的生物合成中發(fā)揮潛在作用?；谝陨戏治?，云谷1號籽粒發(fā)育過程中，花色苷的累積和碳水化合物 (淀粉、糖)的累積應(yīng)該是一致的。但到目前為止，強勢粒和弱勢粒營養(yǎng)物質(zhì)累積差異的生理和分子機(jī)理尚未完全清楚，是因為強、弱勢粒間碳水化合物的分布不均而導(dǎo)致的TAC差異？或是其它原因？筆者的實驗僅僅只是揭示了表面現(xiàn)象，尚需更深入地研究。

4 結(jié) 論

云谷1號糙米粒度、粒重與TAC均為正相關(guān)關(guān)系，影響力從大到小依次為粒厚、百粒重、粒寬、粒長，前三者是影響TAC的重要因素。粒厚超過1.80 mm后，TAC的差異不顯著。盡管同等重量而粒度較小的云谷1號糙米籽粒具有更大的總表面積，但總花色苷含量低于粒度較大的籽粒。粒度的差異不但直接體現(xiàn)了粒重的差異，還體現(xiàn)了TAC的差異。并且構(gòu)成粒度的3個因素間，以及這3個因素與粒重間存在多重共線性。

由于某些原因，實驗只使用了一個產(chǎn)地、一個生長周期的云谷1號黑米樣本，導(dǎo)致實驗結(jié)果不具有普遍代表性，但對依據(jù)粒度、粒重等參數(shù)建立某些營養(yǎng)物質(zhì)含量的評價指數(shù)和預(yù)測模型具有一定的參考價值。