姚宗澤，李 陽(yáng)，郭宗娟，李軍萍，聶貴芳，趙自仙*，李云波

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.杭州中軟安人網(wǎng)絡(luò)通信股份有限公司，浙江 杭州 310012；3.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 玉溪 653100；4.文山市種子管理站，云南 文山 663099；5.安寧市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣所，云南 安寧 650300)

【研究意義】玉米雜種優(yōu)勢(shì)的利用為世界糧食安全做出了巨大貢獻(xiàn)，對(duì)種子行業(yè)的興起、飼料工業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展有重大推動(dòng)作用[1-2]。由于玉米雜交種生產(chǎn)有很大的經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)，種子市場(chǎng)上常出現(xiàn)侵權(quán)或違規(guī)經(jīng)營(yíng)的行為，育種者、經(jīng)營(yíng)者或使用者均很重視種子質(zhì)量。品種的真實(shí)性和純度鑒定對(duì)玉米品種保護(hù)和發(fā)展玉米生產(chǎn)具有重要作用，其中種子純度是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，是影響玉米產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵因素[3]。影響玉米雜交種純度的主要因素有機(jī)械混雜、生物學(xué)混雜等，其中母本去雄不及時(shí)、不徹底是影響種子純度的主要原因[4]。【前人研究進(jìn)展】玉米雜交種純度鑒定的方法有很多，主要有田間種植鑒定和室內(nèi)鑒定。田間種植鑒定是世界公認(rèn)的最準(zhǔn)確、最權(quán)威的純度鑒定方法，但時(shí)間長(zhǎng)、用地多、成本高，對(duì)鑒定的技術(shù)人員有較高要求[5]。室內(nèi)鑒定方法中，形態(tài)學(xué)鑒定易受環(huán)境、種子大小、顏色和成熟度的影響，準(zhǔn)確性差；電泳譜帶鑒定技術(shù)和分子標(biāo)記鑒定法[6]可以獲得較高的準(zhǔn)確率，但操作復(fù)雜，成本較高，不利于推廣應(yīng)用。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)作為第三代分子標(biāo)記，它因可精確到基因組中的單堿基變異，深受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。SNP是指在不同生物個(gè)體DNA序列中的同一位置上，單個(gè)堿基因插入、缺失、顛換、轉(zhuǎn)換等因素導(dǎo)致單核苷酸變異從而造成的基因序列多態(tài)性[7]，1996年由美國(guó)學(xué)者Lander[8]首次提出。SNP所形成的遺傳標(biāo)記具有數(shù)量多、分布廣、適用于大規(guī)模試驗(yàn)及容易估計(jì)等位基因頻率等特點(diǎn)[9-11]。SNP在基因組中分布率極高，是很多物種基因組的最常見形式。目前，國(guó)內(nèi)外主要應(yīng)用于水稻、玉米、辣椒等作物的基因分型和品種鑒定中[12-13]。迄今為止，已開發(fā)出多種檢測(cè)SNP的方法，如DNA測(cè)序法、變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)、基因芯片(Genechips)、TaqMan探針?lè)ā⒏叻直媛嗜劢馇€(High Resolution Melt,HRM)法等。其中，HRM是由于基因片段中的某一單堿基變異引起熔解溫度差異，形成不同的熔解曲線形態(tài)，從而檢測(cè)SNP位點(diǎn)，該技術(shù)可應(yīng)用于基因分型、突變掃描、序列匹配檢測(cè)[14-16]。【本研究切入點(diǎn)】以玉米雜交種家佳榮2號(hào)及其父母本、近似雜交組合JR02為材料，采用田間小區(qū)種植鑒定和SNP分子標(biāo)記中的HRM技術(shù)2種方法對(duì)雜交玉米家佳榮2號(hào)的同一批種子樣品進(jìn)行純度鑒定，用JR02對(duì)SNP分子標(biāo)記鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)研究，驗(yàn)證SNP分子標(biāo)記中HRM技術(shù)鑒定結(jié)果的可靠性，為雜交玉米種子純度鑒定方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

研究材料包括玉米家佳榮2號(hào)雜交種，家佳榮2號(hào)的父本LK-1及母本LK-4，JR02雜交組合，共4份。JR02雜交組合的母本與家佳榮2號(hào)的母本LK-4互為姊妹系，故與家佳榮2號(hào)有親緣關(guān)系，用來(lái)驗(yàn)證所篩選引物的可靠性。研究材料均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)趙自仙教授提供，家佳榮2號(hào)于2012年通過(guò)云南省品種審定，審定編號(hào)滇審玉米2012008號(hào)，區(qū)試中該品種表現(xiàn)出抗病性好、耐貧瘠、適應(yīng)范圍廣，正在云南推廣應(yīng)用。

1.2 田間小區(qū)種植鑒定

試驗(yàn)在尋甸縣大河橋云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)踐基地進(jìn)行，試驗(yàn)地海拔1864 m，東經(jīng)25°31′07″，北緯103°16′41″，試驗(yàn)地塊肥力均勻、中等，前作無(wú)玉米種植。家佳榮2號(hào)雜交種子于2015年5月21日播種，小區(qū)行長(zhǎng)3 m，行距0.75 m，穴距0.42 m，每穴2株，密度63 525 株/hm2。根據(jù)種子檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程和國(guó)家種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[17]，玉米大田用種的種子純度要求96.0 %以上，需種植400/(100-96)，即100株以上，試驗(yàn)實(shí)際播種150粒，符合鑒定標(biāo)準(zhǔn)。6月8日，記錄出苗株數(shù)，逐株編號(hào)掛牌并剪取葉片，單獨(dú)保存，作為室內(nèi)DNA提取材料。每穴的栽培和管理措施一致，管理同大田生產(chǎn)，玉米生長(zhǎng)前期不定苗、不間苗，及時(shí)防蟲。玉米開花期和成熟期，及時(shí)調(diào)查種子純度。

1.3 SNP分子標(biāo)記

1.3.1 DNA提取 分別提取田間采集的家佳榮2號(hào)樣品DNA，用于室內(nèi)雜交種子純度鑒定；再隨機(jī)取20個(gè)家佳榮2號(hào)單株葉片混合，提取總DNA，用于引物篩選。在室內(nèi)培育家佳榮2號(hào)的父母本和JR02雜交組合幼苗，待玉米長(zhǎng)到3～5葉期，每個(gè)材料取20個(gè)單株葉片混合，分別提取DNA，用于引物篩選及驗(yàn)證。采用Saghai-Maroof[18]等于1984年提出的CTAB法提取DNA，再用1 %的瓊脂糖電泳檢測(cè)提取的DNA。

1.3.2 供試引物 通過(guò)查閱文獻(xiàn)，篩選到8對(duì)適用于SNP標(biāo)記的引物(表1)，引物由前人用玉米自交系B73為背景的全基因組中開發(fā)而來(lái)。

1.3.3 SNP分子標(biāo)記——HRM技術(shù) 引物篩選:通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增之后高分辨率熔解過(guò)程中熒光釋放量的采集，完成對(duì)樣品的基因分型以及引物篩選工作。在此過(guò)程中，對(duì)于同一對(duì)引物，采用3種不同顏色的線條分別代表雜交玉米品種家佳榮2號(hào)及其父母本，并繪制出家佳榮2號(hào)及其親本基因組與8對(duì)SNP引物在實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增以及擴(kuò)增產(chǎn)物熔解過(guò)程中的原始熔解曲線、熔解峰、均一化熒光值熔解曲線和熒光值差異曲線，篩選出能準(zhǔn)確區(qū)分家佳榮2號(hào)及其父母本的引物。

表1 SNP引物序列和編號(hào)

表2 Real-Time PCR反應(yīng)體系

所用試劑MeltDoctorTMHRM Master Mix由賽默飛世爾科技有限公司提供，儀器為L(zhǎng)ightCycler480 Software Setup(Roche 羅氏)熒光定量PCR儀，8對(duì)SNP引物Real-Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見表2。試驗(yàn)使用Real-Time PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增過(guò)程中對(duì)每個(gè)樣品的熒光釋放量進(jìn)行采集，同時(shí)在擴(kuò)增結(jié)束后增加一個(gè)60～95 ℃的升溫過(guò)程，并對(duì)各個(gè)樣品管的熒光釋放量進(jìn)行采集和記錄，反應(yīng)程序的設(shè)置見表3。

純度鑒定:在能準(zhǔn)確區(qū)分雜交種與親本的引物中隨機(jī)選取一對(duì)引物，對(duì)田間采集的樣品進(jìn)行純度鑒定，并用JR02加以驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間小區(qū)種植鑒定

玉米家佳榮2號(hào)于2015年7月23日抽雄，7月25日抽絲。第1次鑒定時(shí)間為7月26日，共鑒定了137株，異形株數(shù)為0；第2次鑒定時(shí)間為2015年10月3日，根據(jù)穗形、籽粒顏色、粒刺的有無(wú)、長(zhǎng)短、粒型，并結(jié)合果穗大小等農(nóng)藝性狀進(jìn)行鑒定，共鑒定137株，異形株為3株，純度為(137-3)/137×100 %=97.8 %。純度鑒定結(jié)果取值，取第2次鑒定結(jié)果，即該批種子純度為97.8 %。

2.2 SNP標(biāo)記

2.2.1 SNP引物篩選 在8對(duì)SNP引物的熔解峰結(jié)果中，引物P5的PCR產(chǎn)物熔解雜峰突出，峰值高，熒光值強(qiáng)度高。引物P1、P3、P4、P7、P8的雜峰不大突出，峰值較低。P2和P6的PCR產(chǎn)物熔解峰為單一峰。從均一化熒光值熔解曲線和差異曲線結(jié)果可知，引物P1、P2、P3、P4、P8可以準(zhǔn)確區(qū)分玉米家佳榮2號(hào)雜交種子及其父母本，引物P5、P6、P7未能準(zhǔn)確區(qū)分玉米家佳榮2號(hào)雜交種子及其父母本。能準(zhǔn)確區(qū)分玉米家佳榮2號(hào)雜交種子及其父母本的這5對(duì)引物在親本之間多態(tài)性高，其中P1、P3、P4、P8的熔解峰圖均有雜峰，說(shuō)明引物P1、P3、P4、P8在擴(kuò)增過(guò)程中生成的少量引物二聚體或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)高分辨率熔解曲線準(zhǔn)確度影響較小。引物P2的熔解峰為單一峰，說(shuō)明該引物特異性高。引物P6、P7的均一化熒光值熔解曲線在雜交種和親本間幾乎重合，說(shuō)明這兩對(duì)引物在親本之間沒(méi)有多態(tài)性。引物P5的基因分型結(jié)果不明顯，說(shuō)明可能在擴(kuò)增過(guò)程中生成了較多的引物二聚體或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，影響了高分辨率熔解曲線的準(zhǔn)確度。

表3 Real-Time PCR 擴(kuò)增程序

2.2.2 SNP分子標(biāo)記純度鑒定結(jié)果 8對(duì)SNP引物中能準(zhǔn)確區(qū)分雜交種與親本的引物共有5對(duì)，分別為引物P1、P2、P3、P4、P8，從中隨機(jī)選取引物P3，對(duì)田間采集的137個(gè)樣品進(jìn)行純度鑒定。結(jié)果見圖1，從均一化熒光值熔解曲線圖C中可知，有133個(gè)樣品所對(duì)應(yīng)的曲線位于雙親曲線之間，鑒定為家佳榮2號(hào)雜交種；其余4條曲線，有3條曲線幾乎與父本重合，編號(hào)分別為64號(hào)、67號(hào)、131號(hào)樣品；有1條曲線幾乎與母本重合，為85號(hào)樣品；均被判定為異品種，故引物P3純度檢測(cè)結(jié)果為(137-4)/137=97.1 %。

從圖2可知，JR02雜交組合的均一化熒光值熔解曲線以及差異曲線與家佳榮2號(hào)的曲線有明顯區(qū)別，說(shuō)明引物P3能將玉米雜交種家佳榮2號(hào)與其近似組合JR02準(zhǔn)確區(qū)分出來(lái)。

3 討 論

8對(duì)SNP引物所對(duì)應(yīng)的熔解峰圖中，引物P5的PCR產(chǎn)物熔解峰雜峰突出，峰值高，熒光值強(qiáng)度高，可能是擴(kuò)增過(guò)程中生成了較多的引物二聚體或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。引物P1、P3、P4、P7、P8的雜峰不大突出，峰值較低，在擴(kuò)增過(guò)程中生成的引物二聚體或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的量較少。P2和P6的PCR產(chǎn)物熔解峰為單一峰，說(shuō)明這兩個(gè)引物特異性高，無(wú)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體等生成。

A：原始熔解曲線；B：熔解峰；C：均一化熒光值熔解曲線；D：差異曲線A: Raw melt curves; B: Melting peak; C: The melting curve of normalized fluorescence; D: Difference curve圖1 引物P3鑒定“家佳榮2號(hào)”純度所得的高分辨率熔解曲線Fig.1 The high resolution melt curve for identifying ‘Jiajiarong No.2’ purity by P3

SNP作為第三代分子標(biāo)記，與其它分子標(biāo)記技術(shù)相比，在玉米基因組中廣泛存在，數(shù)量遠(yuǎn)多于其它類型[9]，且具有非此即彼的特性[19]，整個(gè)操作流程可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，人們可以從繁瑣的試驗(yàn)操作中解放出來(lái)。本研究選取的HRM技術(shù)成本低、檢測(cè)周期短、操作較為簡(jiǎn)便，樣品檢測(cè)量少。只有配置PCR反應(yīng)體系屬人為操作，其它步驟均在qPCR儀器內(nèi)完成。qPCR過(guò)程與常規(guī)PCR反應(yīng)相比，僅在PCR結(jié)束后加一個(gè)高分辨率熔解過(guò)程(60～95 ℃)。操作過(guò)程中，只需記錄反應(yīng)體系的熒光釋放量，即可達(dá)到品種純度鑒定的目的，基本實(shí)現(xiàn)了全程閉管操作，極大減少了污染源，整個(gè)鑒定過(guò)程均可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，減少了工作中的人為誤差。MeltDoctorTMHRM Master Mix熒光染料對(duì)PCR的反應(yīng)沒(méi)有抑制作用，在DNA解鏈過(guò)程中也不會(huì)發(fā)生分子遷移，大大提高了HRM技術(shù)的準(zhǔn)確性。然而SNP的HRM技術(shù)在鑒定作物品種純度也存在一定局限性，例如鑒定中需要雜交種雙親的DNA樣品，才能進(jìn)行純度鑒定，此外成本也比其它部分分子標(biāo)記技術(shù)高。任何DNA指紋技術(shù)都不是萬(wàn)能，應(yīng)該根據(jù)SNP檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，充分發(fā)揮其在不同檢測(cè)項(xiàng)目中的作用[10]。隨著科技的進(jìn)步，儀器、試劑等成本下降，SNP的HRM技術(shù)將會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。

A：原始熔解曲線；B：熔解峰；C：均一化熒光值熔解曲線；D：差異曲線A: Raw melt curves; B: Melting peak; C: The melting curve of normalized fluorescence; D: Difference curve圖2 引物P3區(qū)分“家佳榮2號(hào)”及其親本和‘JR02’的高分辨率熔解曲線Fig.2 The high resolution melt curve for distinguishing between ‘Jiajiarong No.2’ and its parents and ‘JR02’ by P3

4 結(jié) 論

采用田間小區(qū)種植鑒定和SNP分子標(biāo)記中的HRM技術(shù)2種方法對(duì)雜交玉米家佳榮2號(hào)的同一批種子樣品進(jìn)行純度鑒定，驗(yàn)證SNP分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的可靠性。結(jié)果顯示，田間小區(qū)種植鑒定純度結(jié)果為97.8 %，8對(duì)SNP引物中共有5對(duì)引物能準(zhǔn)確區(qū)分玉米雜交種家佳榮2號(hào)和親本。隨機(jī)選P3為純度鑒定引物，純度鑒定結(jié)果為97.1 %，與田間鑒定結(jié)果接近。并用與家佳榮2號(hào)有親緣關(guān)系的玉米雜交組合JR02進(jìn)行驗(yàn)證，引物P3能準(zhǔn)確區(qū)分家佳榮2號(hào)與雜交組合JR02。說(shuō)明用SNP分子標(biāo)記HRM技術(shù)鑒定玉米雜交種子純度結(jié)果可靠，可將其作為玉米雜交種子純度鑒定方法之一。