陳 曙，趙秋芳，陳宏良，金 輝*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江 524091；2.農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學重點實驗室 ， 廣東 湛江 524091)

【研究意義】蔗糖作為高等植物光合作用的主要產(chǎn)物，其本身不能被直接利用，需被分解成可溶性糖才能參與植物的各項生理代謝活動[1]。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase，SUS)是植物糖代謝的關(guān)鍵酶之一，與植物細胞組織和骨架的構(gòu)建、植株的生長發(fā)育和果實的成熟以及植物對逆境脅迫的響應等方面密切相關(guān)[2]。因此鑒定和研究植物蔗糖合成酶基因家族對深入了解植物的生長發(fā)育規(guī)律、提高作物抗逆性等方面都有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，植物蔗糖合成酶家族是一個小基因家族，所含基因數(shù)量不多，但不同植物中基因成員數(shù)差別較大。在柑橘中鑒定出3個SUS基因[3]，水稻、擬南芥和橡樹中均發(fā)現(xiàn)6個SUS基因[4-6]，大豆中鑒定出12個SUS基因[7]，以及谷子和葡萄中分別鑒定出9和5個SUS基因[8-9]。所有SUS蛋白序列高度保守，均含有蔗糖合成結(jié)構(gòu)域以及糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域?；虮磉_研究發(fā)現(xiàn)，SUS家族成員具有組織表達特異性。在柑橘中，CitSUSA在柑橘的果實發(fā)育過程階段其表達水平呈上升趨勢，而CitSUS1則表現(xiàn)為下降趨勢，這表明CitSUSA與CitSUS1具有不同的表達模式[3]。在大豆中，對蔗糖合成酶突變體植株的研究發(fā)現(xiàn)SUS酶活性降低會導致根部中根瘤菌固氮能力減弱，部分組織器官發(fā)生退化，植株抗逆能力變差等現(xiàn)象[7]。同樣研究發(fā)現(xiàn)，SoSUS1在甘蔗的葉片、葉鞘以及莖中均有表達，但在莖中的表達量遠高于其他部位，說明甘蔗莖中的含糖量高于其他部位[10]。SUS家族成員除了具有組織特性，參與植物的生長發(fā)育過程外，還與植物對逆境脅迫的應答等方面有關(guān)。呂金印等[11]通過對生育后期的不同小麥品種進行干旱處理，發(fā)現(xiàn)抗旱品種長武134的蔗糖合成酶活性顯著高于敏感品種鄭引1號，且旗葉中的蔗糖和淀粉積累速率明顯高于后者，表明植物蔗糖合成酶可能參與了植物的抗旱過程。王旭明等[12]在孕穗期對水稻進行鹽脅迫處理，結(jié)果顯示在輕度鹽脅迫下水稻葉片中蔗糖合成酶(SS)活性增強，蔗糖和淀粉的積累量增加，植物抗逆性得到加強；但隨著鹽濃度的增大，SS活性明顯降低，蔗糖合成速率降低，植株生長表現(xiàn)出明顯的抑制現(xiàn)象。覃鴻妮等[13]通過對幾種類型玉米品種進行不同的種植密度模式試驗，結(jié)果顯示種植密度對蔗糖含量和蔗糖合成酶的活性影響較大，高密度的種植方式不利于葉片中蔗糖的積累。李曉旭等[14]對發(fā)菜進行干旱處理，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下SUS2的轉(zhuǎn)錄水平和表達量都明顯提升，檢測發(fā)現(xiàn)葉片中蔗糖積累量增加。這些研究表明，植物蔗糖合成酶基因家族成員在植物的生長發(fā)育以及抗逆境脅迫過程中有著重要的作用。玉米是我國主要糧食作物之一，提高玉米的品質(zhì)和產(chǎn)量一直是研究工作的熱點。研究表明，蔗糖合成酶對于植物光合作用中蔗糖的合成和分解、產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運以及細胞組織的構(gòu)建等方面都有著重要作用[15]?！颈狙芯壳腥朦c】隨著植物基因組測序技術(shù)的發(fā)展，目前已完成了對擬南芥[5]、水稻[4]、大豆[7]和谷子[8]等作物中SUS家族基因成員的全基因組的鑒定和功能分析工作，但對于玉米SUS基因家族的研究尚不多見?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于已公布的玉米全基因組測序數(shù)據(jù)(B73)，利用生物信息學對玉米SUS基因家族進行鑒定，并通過生物學軟件對鑒定的玉米SUS基因進行序列特征、理化性質(zhì)、進化關(guān)系等全方面分析，為后續(xù)對玉米SUS家族基因功能的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 玉米SUS基因家族成員的鑒定

根據(jù)已發(fā)表的6個擬南芥蔗糖合成酶基因，在擬南芥數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org)中搜索并下載相關(guān)AtSUS基因信息(AtSUS1-AtSUS6)，其基因序列號分別為AT5G20830、AT5G49190、AT4G02280、AT3G43190、AT5G37180、AT1G73370。以擬南芥蛋白序列為查詢序列，從Ensembl Plants基因組數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)中進行本地Blastp比對搜索，查找出玉米基因組中所有候選的SUS基因，所得結(jié)果利用SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)和PFAM (http://pfam.sanger.ac.uk/)在線軟件進行基因結(jié)構(gòu)分析，剔除無典型蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域和糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的基因序列，最后得到的基因即為玉米SUS基因家族成員。

1.2 蛋白的氨基酸序列屬性分析

利用ExPASy Proteomics Server(http://www.expasy.org/ proteomics )對玉米SUS家族成員進行蛋白分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)分析預測。使用Plant-mPLocServer(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#)在線工具預測玉米SUS蛋白的亞細胞定位。采用bioedit7.0軟件進行氨基酸序列相似性分析。

1.3 基因結(jié)構(gòu)示意圖的繪制

根據(jù)已獲得的玉米SUS家族基因成員的基因組序列和CDS序列，利用在線工具GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn)分析基因結(jié)構(gòu)，明確內(nèi)含子和外顯子的組成，繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站上搜索已公布的擬南芥、水稻SUS家族蛋白成員序列信息，利用ClustalW程序?qū)τ衩?、擬南芥、水稻基因組中所有SUS蛋白序列進行比對，結(jié)合序列比對結(jié)果，利用MEGA6軟件采用鄰接法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。參數(shù)設置：替換模型設置為“Poisson model”，缺口設置為“Pairwise deletion”,校驗參數(shù)Bootstrap method 取值為1000。

1.5 玉米SUS基因啟動子分析

利用在線工具Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析玉米SUS 家族基因上游1500 bp序列，預測SUS基因基序類別和功能特征。

1.6 玉米SUS家族基因組織表達特性分析

玉米SUS基因家族成員在胚、胚乳、花粉、根、芽、花絲、雄蕊組織中的表達數(shù)據(jù)下載自Ensemblplants網(wǎng)站(http://plants.ensembl.org/index.html)。利用百邁客云平臺的在線繪圖工具(http://console.biocloud.net/static/index.html)繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米SUS基因家族成員的鑒定

根據(jù)Blastp比對結(jié)果，最終在Ensembl Plants的玉米數(shù)據(jù)庫中得到5個SUS基因(表1),筆者將這5個基因命名為ZmSUS1～ZmSUS5。ZmSUS1和ZmSUS2定位在1號染色體上，ZmSUS5定位在4號染色體上，ZmSUS3和ZmSUS4則在9號染色體上。5個玉米SUS基因其氨基酸數(shù)量、CDS長度以及分子量都較為接近，大小和長度分別在802aa(ZmSUS3)～849aa(ZmSUS5)、2409 bp(ZmSUS3)～2550 bp(ZmSUS5)以及91.73KD(ZmSUS3)～96.27KD(ZmSUS5)之間變化。蛋白等電點范圍為6.03(ZmSUS4)～7.63(ZmSUS5)，ZmSUS1～ZmSUS4等電點均小于7，蛋白為弱酸性蛋白，ZmSUS5大于7，蛋白為堿性蛋白。

2.2 玉米SUS家族成員的蛋白序列分析

氨基酸序列相似性分析發(fā)現(xiàn)，玉米SUS蛋白成員的氨基酸序列相似程度較高(表2)，在51.31 %～97.81 %，其中ZmSUS1與ZmSUS2相似度最高(97.81 %)，其次為ZmSUS3～ZmSUS4(80.52 %)，相似度最低的為ZmSUS4和ZmSUS5，相似度為51.31 %。對玉米SUS蛋白家族成員進行蛋白序列屬性分析(表3)，結(jié)果顯示玉米SUS蛋白結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)折、擴展鏈以及無規(guī)則卷曲組成，其中α-螺旋所占比例最高，所占比百分比范圍為51.94 %(ZmSUS5)～55.51 %(ZmSUS4)，β-轉(zhuǎn)折所占比例最小，僅為6.55 %(ZmSUS1)～6.98 %(ZmSUS3)。蛋白穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，ZmSUS1～ZmSUS4不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，鑒定為穩(wěn)定蛋白，ZmSUS5不穩(wěn)定系數(shù)大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白。蛋白親水性預測結(jié)果顯示ZmSUS1～ZmSUS5均為疏水性蛋白。對玉米SUS家族蛋白成員進行亞細胞定位預測，結(jié)果顯示所有蛋白均定位在葉綠體。

表1 玉米SUS家族基因信息

表2 玉米SUS蛋白成員氨基酸序列相似性分析

表3 玉米SUS家族成員蛋白序列分析

2.3 玉米SUS家族成員基因結(jié)構(gòu)分析

前人研究表明，植物中不同物種間的SUS基因結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子和外顯子數(shù)目具有高度保守性[15]。本研究中對玉米SUS基因家族成員進行基因結(jié)構(gòu)分析(圖1)，結(jié)果顯示玉米SUS成員可分為3組，SUSI中ZmSUS1、ZmSUS2均含有14個內(nèi)含子；SUSII中ZmSUS3含有14個內(nèi)含子，ZmSUS4含有13個內(nèi)含子；ZmSUSⅢ中，ZmSUS5含有10個內(nèi)含子?；蚪Y(jié)構(gòu)示意圖顯示，ZmSUS1與ZmSUS2以及ZmSUS3與ZmSUS4的基因結(jié)構(gòu)具有高度相似性，與表2中的SUS蛋白氨基酸序列一致性結(jié)果相呼應。

2.4 玉米、擬南芥和水稻SUS基因家族系統(tǒng)進化分析

前人對植物SUS基因系統(tǒng)進化研究中，植物SUS基因被分為3組，分別是SUSⅠ、SUSA以及New Group[16]。為了了解玉米SUS家族基因的進化關(guān)系，本研究對玉米、擬南芥和水稻3種作物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行系統(tǒng)進化分析。圖2顯示，17個SUS基因分為3組，分別為SUSⅠ、SUSⅡ和SUSⅢ。SUSⅠ中擬南芥SUS基因有2個，水稻SUS蛋白有3個，玉米SUS蛋白有2個(ZmSUS3、ZmSUS4)；SUSⅡ中分布有2個擬南芥SUS蛋白，1個水稻SUS蛋白以及2個玉米SUS蛋白(ZmSUS1、ZmSUS2)；SUSⅢ中分布有2個擬南芥SUS蛋白，2個水稻SUS蛋白和1個玉米SUS蛋白(ZmSUS5)。對水稻、玉米、擬南芥SUS基因進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)了4對物種內(nèi)部的旁系同源基因(擬南芥2對，水稻1對，玉米1對)，2對物種間的直系同源基因(ZmSUS4與OsSUS3，ZmSUS5與OsSUS6)。,這些現(xiàn)象表明，在玉米、擬南芥、水稻的基因組中，蔗糖合成酶基因家族按照各自物種的特異性進行了擴展，從而更好的適應環(huán)境，這種現(xiàn)象在植物各類基因家族中普遍存在。

2.5 玉米SUS基因啟動子分析

對玉米SUS家族蛋白基序進行分析，結(jié)果如表4所示，說明SUS基因在植物的生長發(fā)育、逆境脅迫等方面發(fā)揮了重要作用。玉米SUS家族蛋白預測發(fā)現(xiàn)13類基序，可分為4大類，分別為植物激素調(diào)控元件、逆境脅迫相關(guān)元件、光反應元件和生長發(fā)育調(diào)控元件。其中涉及激素調(diào)控的元件有ABA應答元件、MeJA響應元件、GA應答元件、IAA以及乙烯調(diào)控元件；與逆境脅迫(生物與非生物脅迫)相關(guān)的元件為干旱響應元件、厭氧誘導元件、低溫脅迫調(diào)控元件以及真菌誘導元件；胚乳發(fā)育以及蛋白代謝調(diào)控元件均與植物生長發(fā)育調(diào)控相關(guān)；光反應調(diào)控元件在玉米SUS家族基因中數(shù)量最多，其中ZmSUS4中含量最大，為12個，ZmSUS1和ZmSUS3最少，均含有7個，表明玉米SUS家族基因成員在植物光合反應的調(diào)控過程中均有參與，多數(shù)光調(diào)控相關(guān)基序具有相同或類似功能。除光合作用元件外，玉米SUS家族基因含有植物激素調(diào)控元件、逆境脅迫相關(guān)元件以及生長發(fā)育調(diào)控元件的數(shù)量都較少，為0～2個。例如在低溫調(diào)控方面，僅ZmSUS4含有1個調(diào)控元件，這表明在植物生長過程中，若ZmSUS4發(fā)生突變致使該調(diào)控元件功能缺失或變異，因沒有相同或類似功能元件替代，在遭遇低溫冷害時可能會導致植株生長受阻甚至死亡。

2.6 玉米SUS家族基因組織表達分析

組織特異性表達分析結(jié)果顯示，玉米SUS基因在不同組織間的表達模式差異明顯(圖3)。ZmSUS1和ZmSUS2在胚和胚乳中表達較高，在其它被檢測組織中很低或者不表達，表明它們可能參與了種子的發(fā)育過程。ZmSUS5在根、芽、雄穗及花絲中表達量均很低，在胚、胚乳、花粉中不表達，可認為在玉米的生長發(fā)育過程中，ZmSUS5沒有參與上述被檢測的組織特定時期的生理活動。ZmSUS3及ZmSUS4在被檢測的組織中均有較高的表達量，說明它們參與了玉米生長發(fā)育過程中的多個過程。

圖1 玉米SUS基因結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Intron-exon structure analysis of SUS genes in maize

▲代表水稻；■代表玉米；●代表擬南芥圖2 玉米、擬南芥、水稻SUS蛋白的系統(tǒng)進化分析和亞組分類Fig.2 Phylogenetic relationship and subgroup division of SUS proteins of maize, arabidopsis and rice

3 討 論

蔗糖作為植物光合作用的主要產(chǎn)物之一。蔗糖合成酶是蔗糖代謝調(diào)節(jié)過程中的關(guān)鍵酶，在植物的生長發(fā)育過程中有著重要作用。通過生物信息學鑒定和分析蔗糖合成酶基因是了解基因的功能、調(diào)控模式以及分子機制的第一步。近年來隨著植物基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，已逐漸對水稻[17]、擬南芥[18]、大豆[8]等作物進行了蔗糖合成酶基因家族成員的鑒定，并通過相關(guān)工具進行了基因理化性質(zhì)的分析和功能預測等，發(fā)現(xiàn)該基因家族對維持作物的生長發(fā)育以及逆境脅迫的應答等方面都具有重要作用。2009年11月，玉米材料B73全基因組測序工作完成[19]，然而對玉米蔗糖合成酶基因家族的研究尚未見報道。本研究中，利用已公布的玉米全基因組數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學比對方法，共鑒定出5個玉米SUS家族成員，結(jié)果分析顯示，除ZmSUS5外，其余各成員在氨基酸長度、分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、親水性以及基因結(jié)構(gòu)等方面均較為相似，體現(xiàn)了蔗糖合成酶家族基因在進化過程中的高度保守性?；蛟谶M化的過程中一般都具有很高的保守性，但仍有極少數(shù)基因會發(fā)生突變，從而產(chǎn)生新的生物學功能，促進了物種的進化。氨基酸序列相似性分析表明，ZmSUS1～ZmSUS4相互的序列相似性都較高，其中ZmSUS1與ZmSUS2之間氨基酸序列相似性達97.81 %，表明ZmSUS1與ZmSUS2應互為同源基因，這與Carlson等[20]的研究結(jié)果保持一致。前人研究表明，基因的內(nèi)含子/外顯子的排序特征對研究基因的功能和進化關(guān)系具有重要的意義[21]。本研究中，玉米SUS家族基因成員的內(nèi)含子數(shù)目在10～14個，同樣，大豆和棉花中內(nèi)含子數(shù)量均在11～14個[7,22]，說明不同物種中，蔗糖合成酶家族基因的內(nèi)含子和外顯子的數(shù)目是高度保守的。而在各基因中，內(nèi)含子的位置和長度卻存在較大差別。在植物漫長的進化過程中，基因中內(nèi)含子經(jīng)過移位或內(nèi)部之間的非法交換，產(chǎn)生了具有不同功能的新基因，進而形成了最終的基因家族[23]。

表4 玉米SUS蛋白啟動子分析

條帶代表玉米SUS基因在不同組織的相對表達量，大小用表示圖3 玉米SUS家族基因的組織表達分析Fig.3 The relative expression analysis of maize SUS family members in different maize tissues

本文利用玉米、擬南芥和水稻泛素結(jié)合酶家族基因的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，旨在研究不同物種間泛素結(jié)合酶家族蛋白的進化關(guān)系，并通過生物信息學分析結(jié)果預測玉米SUS家族基因的功能。系統(tǒng)進化結(jié)果顯示，玉米SUS蛋白家族可分為3個亞家族，各亞家族SUS基因在進化上表現(xiàn)出差異性，暗示了SUS基因功能的多樣性?；騿幼臃治鼋Y(jié)果顯示，所有玉米SUS家族蛋白成員均含有多個光反應元件，說明在植物進化過程中逐漸產(chǎn)生了多個同源基因，從而避免了植株在生長過程中由于突變致使單個基因功能的缺失而導致植株生長受阻甚至死亡的現(xiàn)象。同時玉米SUS基因中還含有數(shù)量不等的激素調(diào)控元件、逆境脅迫調(diào)控元件和生長發(fā)育相關(guān)元件，表明玉米SUS家族成員也與上述相關(guān)反應過程有關(guān)。對玉米SUS家族成員進行組織特異性表達研究發(fā)現(xiàn)，玉米SUS家族基因成員具有不同的表達模式。ZmSUS1與ZmSUS2均為SUSⅠ亞家族中成員，主要在種子胚和胚乳中表達，其它組織中表達量很低或不表達，說明ZmSUS1與ZmSUS2的主要功能與種子的發(fā)育過程有關(guān)。如擬南芥中的AtSUS2基因只有在開花后10 d左右的種子中高度表達，在其它組織中的表達水平幾乎檢測不到[5]。水稻中OsSUS4基因主要表達部位在雌蕊以及幼胚，對OsSUS4基因表達進行抑制，導致種子成熟期推遲以及水稻產(chǎn)量變低[4]。通過對玉米SUS家族基因成員表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，ZmSUS1、ZmSUS2在種子的胚和胚乳中特異性高表達，但對其如何影響種子的發(fā)育過程并不清楚，需后續(xù)對該基因做功能抑制或過表達實驗進一步研究。SUSII中，ZmSUS3與ZmSUS4在被檢測的組織中均有較高程度地表達，說明其表達不具有組織特異性。ZmSUS5分布在SUSⅢ中，在被檢測組織中表達量很低或不表達，而在組織內(nèi)部之間比較，其表達部位為根、芽以及雄穗，在植物生長發(fā)育的后期則不表達，這與喬亮等[24]在水稻中對OsSUS5和OsSUS6基因的表達模式的研究結(jié)果保持一致，同時也與本研究中進化樹分析將ZmSUS5與OsSUS5和OsSUS6劃分為SUSⅢ成員的結(jié)果相吻合。玉米SUS家族成員在基因表達模式中表現(xiàn)出了差異，這暗示了玉米SUS家族基因在進化過程中其基因功能可能發(fā)現(xiàn)了突變和自然選擇的作用。

玉米是我國主要的糧食作物之一，在生長發(fā)育過程中會遇到干旱、低溫和病蟲害等各種生物或非生物脅迫，嚴重影響玉米的產(chǎn)量[25]。蔗糖合成酶作為一直以來研究的熱點，近年來被發(fā)現(xiàn)與作物抗逆性密切相關(guān)。如花生中AhSuSy在高鹽或干旱的條件下，其在根部中的表達量明顯增加[26]。低溫和干旱條件誘導下，橡膠HbSus5基因在葉片和根部中大量表達，表明HbSus5參與了植株的脅迫應答反應[6]。同樣，Zuzanna[5]等利用T-DNA插入方法研究擬南芥中各基因的表達模式，結(jié)果顯示，在植株根部缺氧的條件下，雙突變體AtSUS1/AtSUS4植株表現(xiàn)出明顯的生長延遲和糖分積累速率變緩，其蔗糖合成酶活性相比野生型植株不足3 % 。本研究中，對玉米SUS家族基因成員啟動子進行分析發(fā)現(xiàn)，各基因均含有抗逆境脅迫相關(guān)元件，表明玉米SUS基因家族可能參與了玉米抗逆境脅迫相關(guān)活動，但具體關(guān)于玉米SUS家族基因在逆境下的表達特性以及對植株生長發(fā)育的影響仍不清楚，需后續(xù)進一步對相關(guān)基因的功能和分子機制進行研究。

4 結(jié) 論

玉米SUS家族基因在玉米的多個組織器官中均有表達，各基因在玉米不同組織器官中表達具有特異性，具有不同的表達模式。各成員中均含有關(guān)于植物生長發(fā)育、激素及逆境調(diào)控等相關(guān)元件，推測玉米SUS家族基因可能參與了上述相關(guān)調(diào)控反應。