崔華媛，姚 丹，汪鈺翔，胡一橋

(南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210093)

光動力治療(photodynamic therapy，PDT)是一種很有前景的腫瘤治療新手段，其由3個重要部分組成：特定波長的光、光敏劑和組織中的分子氧。三者共同發(fā)揮作用，通過產(chǎn)生高水平的單線態(tài)氧(single oxygen，1O2)選擇性的破壞腫瘤組織以達到治療目的[1]。與傳統(tǒng)的腫瘤治療手段相比，它具有高效、選擇性好、不良反應(yīng)小的優(yōu)點[2]。光動力治療的效果一方面取決于光敏劑的量子轉(zhuǎn)化產(chǎn)率及其在腫瘤組織中的濃度分布[3]，另一方面與腫瘤部位的氧氣濃度密切相關(guān)[4]。但由于腫瘤組織的致密性、快速代謝能力以及血管不完整性等特點，腫瘤高度乏氧，大大限制了光動力治療對腫瘤細胞的殺傷效果[5]。

為了克服以上缺陷，研究者們尋找多種治療策略來提高光動力的治療效果。例如，有研究者利用納米技術(shù)開發(fā)了更高效的光敏劑或者提高了光敏劑對腫瘤組織的靶向性[6]。同時針對氧氣供應(yīng)這個關(guān)鍵因素[7]，研究者們主要通過增加腫瘤內(nèi)部的氧氣含量去增效光動力治療，例如血紅蛋白載氧體系、全氟化碳載氧體系、腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性產(chǎn)氧體系(過氧化氫酶和二氧化錳納米粒)、水分解體系等[6-12]。近年來高氧化態(tài)的錳吸引了大量研究者的關(guān)注，因為其可以利用腫瘤微環(huán)境中過表達的過氧化氫(H2O2)特異性產(chǎn)氧，逆轉(zhuǎn)腫瘤乏氧微環(huán)境[13-14]。一些課題組以卟啉為基礎(chǔ)開發(fā)了一系列的新型納米金屬有機骨架納米載體(nMOFs)，其在高效遞送光敏劑的同時，實現(xiàn)了腫瘤微環(huán)境的特異性產(chǎn)氧，從而提升光動力治療的殺傷作用[15-16]。

目前，尚未有研究報道過納米級的異核高氧化態(tài)錳金屬有機框架。因此在本研究中，首次描述了一種錳簇卟啉金屬有機框架納米載體(nMn-MOF)，并將其應(yīng)用于腫瘤的光動力治療。該納米載體通過催化腫瘤微環(huán)境過表達的H2O2反應(yīng)提供氧氣，同時在近紅外光照射下，該納米載體還能將氧氣轉(zhuǎn)化成具有細胞毒性的1O2，實現(xiàn)光動力治療的增效。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

硝酸鈰銨、四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)、氯化錳四水合物[薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司]；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三氟乙酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；CCK-8試劑(日本株式會社同仁化學(xué)研究所)；HIF-1α抗體(美國賽默飛世爾有限公司)；其他試劑均為市售分析純。細胞株：CT26細胞(南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院)。

1.2 儀 器

CAD4/PC型X射線衍射儀(荷蘭Enraf Noius公司)；UV-2450紫外-可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；Safire多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；Zetasizer Nano納米粒度儀(英國Malvern公司)；NEXUS870傅里葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet公司)；OX25克拉克氧探針(丹麥Unisense公司)；FV3000激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；PHI 5000 X射線光電子能譜儀(日本UlVAC-PHI公司)；JEM-200CX透射電鏡(日本Jeol公司)。

2 方 法

2.1 化學(xué)合成

2.1.1 CeMn6O9(CH3COO)9(NO3)(H2O)2簇(錳簇)的制備 在前人研究的基礎(chǔ)上，進行了錳簇的合成[17]。向H2O/CH3COOH(7 mL/7 mL)中緩慢加入(NH4)2[Ce(NO3)6]橙色溶液6.78 g(12.4 mmol)至近無色，向H2O/CH3COOH(4 mL/4 mL)中加入Mn(CH3COO)2·4H2O 2.02 g(8.2 mmol)并攪拌。所得到深紅棕色溶液室溫靜置2 d后，過濾得到[CeMn6O9(CH3COO)9(NO3)(H2O)2]·H2O·4CH3COOH黑色結(jié)晶，用低溫丙酮和乙醚各10 mL洗滌，真空干燥。得到0.98 g目標產(chǎn)物(其中錳含量54%)。

2.1.2nMn-MOF的制備 將[CeMn6O9(CH3COO)9(NO3)(H2O)2]·H2O·4CH3COOH 10.0 mg，TCPP 7.5 mg，三氟乙酸100 μL，DMF 5.0 mL置于10 mL派熱克斯玻璃瓶中，超聲使溶解，在150 ℃烘箱中反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，得到黑色棒狀晶體，超聲剝離分散3次(強度40%，每次6 min),得到納米級Mn-MOF，命名為nMn-MOF。

2.1.3 (Mn3O)2(TCPP)3(Mn-MOF)的制備 取DMF 2 mL于4 mL派熱克斯玻璃瓶中，加入MnCl2·4H2O 5.0 mg，TCPP 4.3 mg，三氟乙酸 75 μL，超聲使其溶解。在150 ℃烘箱中反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，得到黑色棒狀晶體[18]，將其命名為Mn-MOF。

2.2 粒徑、電位和穩(wěn)定性試驗

使用動態(tài)光散射儀(DLS)測定nMn-MOF(100 μg/mL)的粒徑分布、電位，并在不同條件下對水中和血清中nMn-MOF的穩(wěn)定性進行考察。

2.3 體外產(chǎn)氧

為了比較nMn-MOF與TCPP產(chǎn)氧能力，使用氧探針對O2產(chǎn)生量進行檢測。所有溶液均用氮脫氧后，將氧探針浸入樣品溶液(50 μg/mL，4 mL)中數(shù)分鐘以平衡系統(tǒng)。將H2O220 μL(20 mmol/L)注入待測溶液中，使腫瘤微環(huán)境過氧化氫終濃度為100 μmol/L記錄氧濃度變化。

2.4 體外單線態(tài)氧檢測

溶液用氮脫氧后，將樣品 100 μL(TCPP和nMn-MOF劑量為分別為5 μg/mL)，H2O210 μL(1 mmol/L)和150 μg/mL吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)20 μL在黑色96孔板中混合。用液體石蠟密封，創(chuàng)造出乏氧環(huán)境。使用635 nm的激光照射6次(30 mW/cm2)，每次10 s，測量780 nm處的ICG吸收。每組實驗平行3次。

2.5 光熱性能檢測

將不同質(zhì)量濃度的樣品(0,0.5 mg/mL和2 mg/mL)用635 nm的激光照射10 min(30 mW/cm2)，測其溫度變化。每組實驗平行3次。

2.6 TCPP定量分析

為了確定MOF中配體TCPP的量，用紫外分光光度計檢測在438 nm處的TCPP水溶液(5.0,7.5,10.0,15.0,20.0 μg/mL)的吸收度來獲得校準曲線。根據(jù)MOF在450 nm處的吸收度，確定MOF中的TCPP量。

Figure 1 Absorption spectra of meso-tetra (4-carboxyphenyl) porphine (TCPP) aqueous solution at varied concentration (A);and the calibration plot of TCPP (B)

2.7 細胞毒性檢測

為了評估nMn-MOF納米顆粒的暗細胞毒性，用CCK-8測定其安全性。將CT26細胞以每孔5 000 個細胞的密度接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h。用TCPP、nMn-MOF(配體質(zhì)量濃度分別為2.5,7.5,10,12.5和20 μg/mL)處理細胞并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，然后加入CCK-8 10 μL并培養(yǎng)1 h。最后，使用酶標儀在450 nm處測量吸收度。對照為RPMI 1640培養(yǎng)的細胞。

為了評估在乏氧和常氧條件下nMn-MOF的治療效果，與上述實驗類似，將CT26細胞以每孔5 000 個細胞的密度接種到兩個96孔板中。培養(yǎng)24 h后，將一個平板轉(zhuǎn)移到含有5% CO2和95% N2的乏氧環(huán)境中，另一個依然在常氧條件下培養(yǎng)，兩者均繼續(xù)培養(yǎng)6 h。將TCPP或nMn-MOF以2.5,7.5,10,12.5和20 μg/mL的劑量加入到細胞中。在乏氧和常氧條件下再分別培養(yǎng)4 h后，用LED照射細胞2 h。將細胞進一步溫育24 h，使用CCK-8法測定細胞活力。

為了評估nMn-MOF的催化性能，研究了不同H2O2質(zhì)量濃度下的nMn-MOF的光細胞毒性。H2O2的安全范圍是100～300 μmol/L，將nMn-MOF(以配體質(zhì)量濃度計12.5 μg/mL)和梯度濃度的H2O2加入細胞中，至乏氧環(huán)境孵育。2 h后用LED燈照射2 h。使用CCK-8法測定細胞活力。

2.8 nMn-MOF的細胞攝取

為了研究nMn-MOF與CT26細胞之間的相互作用，在24孔板中每孔接種CT26細胞2.5×104個，培養(yǎng)24 h。向每個孔中加入nMn-MOF(以配體質(zhì)量濃度計5 μg/mL)并孵育1 h。用PBS洗滌2次，加入多聚甲醛固定，用1滴3%甘油將細胞載玻片倒置在另一個載玻片上，用共聚焦顯微鏡拍攝細胞的熒光圖像。

2.9 nMn-MOF改善細胞乏氧研究

為了研究nMn-MOF對CT26細胞乏氧的改善作用，將CT26細胞以每孔2.5×104個細胞的密度接種到24孔板中，培養(yǎng)24 h后，將細胞置于乏氧環(huán)境中4 h。細胞分成3組，從乏氧環(huán)境中取出后立即將PBS，TCPP，nMn-MOF加入細胞中并在低氧環(huán)境中孵育2 h。用PBS處理后，將細胞與兔抗小鼠標記的HIF-1α抗體(1∶800稀釋)在37 ℃溫育1 h，然后用FITC標記的大鼠抗兔的IgG(1∶800稀釋)染色，37 ℃保溫1 h。用熒光顯微鏡拍攝細胞的熒光圖像。

2.10 nMn-MOF對CT26細胞中活性氧的影響

在24孔板中每孔接種CT26細胞2.5×104個并孵育24 h。將細胞分成3組：PBS，TCPP，nMn-MOF，在乏氧環(huán)境下孵育4 h。取出后，分別加入PBS，TCPP(12.5 μg/mL)，nMn-MOF(以配體質(zhì)量濃度計為12.5 μg/mL)。加入PBS稀釋的H2DCFDA，每孔100 μL。將3組細胞再次轉(zhuǎn)移到乏氧環(huán)境中培養(yǎng)2 h。取出后，用LED照射細胞 2 h。取出細胞并用PBS處理，用熒光顯微鏡拍攝細胞的熒光圖像。

3 結(jié)果與討論

3.1 nMn-MOF的表征

nMn-MOF在X射線粉末衍射(powder X-ray diffraction,PXRD)中顯示，其峰高8.03°，衍射峰寬20.30°(圖2-A)，與Mn-MOF相同，表明nMn-MOF與Mn-MOF有類似的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)與Zhou課題組報道的結(jié)構(gòu)類似[19]。紫外-可見吸收光譜證實了nMn-MOF改善了Mn-MOF的光物理性質(zhì)：TCPP在419 nm處具有分裂的Soret帶，在516，549，590和647 nm處具有4個Q帶，這是由于S0→S2和S0→S1的躍遷產(chǎn)生的。在nMn-MOF納米載體合成過程中，在468 nm處的Soret帶紅移，僅剩兩個與TCPP相關(guān)的Q帶，峰值出現(xiàn)在563和601 nm(圖2-B)[17]。傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)也說明了nMn-MOF保留了錳團簇的特征吸收峰，隨著配位螯合的形成，TCPP羧基官能團的C==O在1 707 cm-1處的伸縮振動明顯減弱，在1 680 cm-1處出現(xiàn)了新的弱吸收峰。nMn-MOF在1 613 cm-1和1 427 cm-1處出現(xiàn)相同的吸收峰，這可能是由于C==C骨架振動和C-H面內(nèi)彎曲振動產(chǎn)生的。實驗證明，nMn-MOF和TCPP分子有類似的紅外光譜(圖2-C)。TCPP和nMn-MOF的熒光光譜顯示它們在419 nm的激發(fā)光照射下，在658 nm處熒光較強(圖2-D)，或可應(yīng)用于細胞攝取成像。

Figure 2 (A)PXRD pattern of in nanoscale Mn-metal-organic framework (nMn-MOF) comparison to Mn-MOF and Mn-clusters;(B)UV-visible spectra ofnMn-MOF,Mn-Clusters,TCPP, physically mixed TCPP and Mn-clusters;(C)FT-IR spectrum ofnMn-MOF and TCPP;(D)Fluorescence spectrum ofnMn-MOF and TCPP

透射電鏡(TEM)拍攝了nMn-MOF的納米形態(tài)(圖3-A)。單個nMn-MOF納米粒的尺寸在200 nm左右。動態(tài)光散射(DLS)測定結(jié)果表明，nMn-MOF在去離子水中的平均直徑為210 nm，多分散指數(shù)為0.159，Zeta電位為-15.43 mV(圖3-B)。在24 h內(nèi)，nMn-MOF納米粒在水和血清中的尺寸沒有顯著變化。將nMn-MOF用X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)檢測，結(jié)果表明Mn4+作為單組分對應(yīng)物的移位結(jié)合能為641.00 eV，而Mn簇中的Mn4+為641.37 eV，不同于Mn-MOF中Mn2+的642.20 eV(圖3-C)[18]，這表明nMn-MOF具有高氧化性，可以將H2O2轉(zhuǎn)化為O2。氧探針檢測的O2質(zhì)量濃度隨時間變化的規(guī)律顯示，與TCPP相比，nMn-MOF能夠產(chǎn)生更多O2(圖3-D)。

Figure 3 (A)TEM image ofnMn-MOF;(B)Size distribution and Zeta potential ofnMn-MOF;(C)XPS overlay ofnMn-MOF (red line) with its single component counterparts,Mn-clusters (blue line);(D)Time-dependent O2generation probed by an oxygen sensor

3.2 nMn-MOF的體外研究

根據(jù)實驗方法考察了常氧和乏氧條件下nMn-MOF的1O2產(chǎn)生情況。在常氧環(huán)境下，水中的nMn-MOF和游離的TCPP均以光照依賴性的方式產(chǎn)生1O2(圖4-A)。在體外模擬的乏氧環(huán)境中(100 μmol/L H2O2，<1% O2環(huán)境)對nMn-MOF和TCPP的1O2生成效率進行了比較。在沒有H2O2存在時照射nMn-MOF幾乎不產(chǎn)生1O2。在乏氧條件下，向nMn-MOF中添加H2O2后，1O2生成量顯著增加，這可能是由于錳簇的高氧化性造成的。與其相反，在H2O2(100 μmol/L)低氧環(huán)境中TCPP和對照組經(jīng)近紅外燈照射后僅產(chǎn)生微量的1O2(圖4-B)。此外，還評估了nMn-MOF的光熱效應(yīng)。在nMn-MOF(2.0和0.5 mg/mL)和水中未見溫度明顯升高(圖4-C)。結(jié)果表明，nMn-MOF可以作為PDT光敏劑，對光熱療法增效不明顯。此外，對制劑的穩(wěn)定性研究顯示，nMn-MOF在24 h內(nèi)不論是在25 ℃還是在生理條件下都有較好的穩(wěn)定性(圖4-D)。

在此基礎(chǔ)上，進一步研究了納米載體的生物學(xué)效用。在分析細胞光毒性之前，使用CCK-8考察nMn-MOF對CT26細胞的暗毒性。即使在質(zhì)量濃度20 μg/mL時，nMn-MOF仍未對CT26細胞顯示出明顯的暗毒性(圖5-A)。在常氧條件下，nMn-MOF和TCPP對CT26細胞都表現(xiàn)出較高的光毒性(圖5-B)。另外，在低氧環(huán)境下，僅光誘導(dǎo)的nMn-MOF對CT26腫瘤細胞仍表現(xiàn)出較高水平的細胞殺傷性，這種高光細胞毒性可能是錳簇的氧供效應(yīng)引起的(圖5-C)。進一步研究H2O2的濃度梯度顯示，在沒有近紅外光照射時，即使nMn-MOF質(zhì)量濃度高達300 μmol/L，CT26細胞的活性仍保持在90%左右。這是由于H2O2在nMn-MOF作用下迅速分解為O2。在近紅外光下照射下，產(chǎn)生的氧進一步轉(zhuǎn)化為具有細胞毒性的1O2(圖5-D)。

由于在乏氧環(huán)境下nMn-MOF的活性氧(oxygen species,ROS)產(chǎn)率較高，用CT26細胞研究了nMn-MOF在體外的治療效果。激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)反映了其被細胞攝取和分布的情況。CLSM顯示出較強的紅色熒光信號，這表明nMn-MOF能夠被CT26細胞內(nèi)化(圖6-A)。此外，乏氧會導(dǎo)致CT26細胞中HIF-1α積累。用nMn-MOF處理后，HIF-1α的熒光強度明顯降低(圖6-B)。這些結(jié)果表明，nMn-MOF可有效改善細胞水平的乏氧。利用H2DCFDA作為ROS探針，繼續(xù)研究了nMn-MOF在乏氧條件下在細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況，nMn-MOF在乏氧環(huán)境中綠色熒光強于CT26細胞，這表明其能產(chǎn)生ROS(圖6-C)。綜上所述，即使在乏氧腫瘤微環(huán)境下，nMn-MOF仍可發(fā)揮增效光動力治療的作用。

Figure 6 Cellular uptake and penetration ofnMn-MOFinvitro

A:Confocal laser scanning microscopy (CLSM) images of CT26 cells after treatment withnMn-MOF.Red regions indicated localization ofnMn-MOF in the cells;B:CLSM images of green fluorescent intranuclear HIF-1α expression in cells;C:CLSM images of green fluorescent intranuclear ROS expression in cells

4 結(jié) 論

在本研究中，開發(fā)了一種新型錳-金屬有機框架納米載體。實驗結(jié)果表明，這一納米載體能改善PDT中的腫瘤乏氧，產(chǎn)生的單線態(tài)氧可有效殺傷腫瘤細胞，在PDT治療中發(fā)揮重要作用。同時，nMn-MOF可能在廢水處理，免疫佐劑，核磁共振成像(NMRI)等方面也具有一定的應(yīng)用價值。