張瑤丹，姜新宇，操蘭潔，王 杰，蔣翠花，趙夢鴿，張 健，殷志琦*

(1萬邦德制藥集團(tuán)杭州醫(yī)藥技術(shù)有限公司，杭州 310000；2湖南華寶通制藥有限公司，長沙 410331；3中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥制劑系&天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；4江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京 210028)

高脂血癥極易誘發(fā)動脈粥樣硬化、冠心病等其他心腦血管疾病，嚴(yán)重威脅患者健康，據(jù)統(tǒng)計，預(yù)計到2020年，心腦血管疾病的病死率會達(dá)到37%[1]。目前臨床一線用藥為他汀類，主要通過競爭性抑制內(nèi)源性膽固醇合成限速酶即HMG-CoA還原酶，阻斷細(xì)胞內(nèi)羥甲戊酸代謝途徑，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成減少[2]。但許多患者接受他汀類藥物治療后達(dá)不到美國國家衛(wèi)生研究院提出的降脂目標(biāo)，且部分患者會產(chǎn)生耐藥性，多項(xiàng)臨床研究報道他汀類藥物在降脂的同時可能會引起體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶升高，從而影響肝功能[3-4]。天然藥物具有多靶點(diǎn)、多機(jī)制和整體協(xié)同的作用特點(diǎn)，對于高脂血癥等長期慢性疾病的治療具有可長期服用，不良反應(yīng)小等優(yōu)勢，因此成為降脂藥物開發(fā)應(yīng)用的關(guān)注焦點(diǎn)。將天然藥物與化學(xué)藥聯(lián)合用藥，具有減毒增效的潛力，是臨床降脂用藥趨勢和今后研究的重點(diǎn)[5-6]。

絞股藍(lán)[GynostemmaPentaphyllum(Thunb.) Makino]是葫蘆科絞股藍(lán)屬植物，民間稱其為“不老藥草”，又名“南方人參”，主要含有人參皂苷Rb1等多種皂苷類成分[7]。1986年國家科委在“星火計劃”中，把絞股藍(lán)列為待開發(fā)的“名貴中藥材”之首。目前藥理研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷具有降血脂、保肝、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤及保護(hù)心腦血管等多種藥理活性[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)以絞股藍(lán)總苷顆粒為評估對象，采用高脂飼料誘導(dǎo)高脂血癥C57BL/6J小鼠模型，評估其對高脂血癥C57BL/6J小鼠的降脂作用以及對血清轉(zhuǎn)氨酶的影響，尤其考察該產(chǎn)品與阿托伐他汀聯(lián)合用藥的降脂藥效和安全性，并初步探索其調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)機(jī)制。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

總膽固醇測定試劑盒(批號20160729)、甘油三酯測定試劑盒(批號20160729)、高密度脂蛋白試劑盒(批號20160729)、低密度脂蛋白試劑盒(批號20160729)、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶測試盒(批號20160729)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶測試盒(批號20160729)、鼠源載脂蛋白B ELISA試劑盒(批號20160729)，以上均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。阿托伐他汀片為輝瑞制藥有限公司產(chǎn)品(批號20151126)。

絞股藍(lán)總苷顆粒[湖南華寶通制藥有限公司；批號：20160302；規(guī)格：每袋裝3 g(含絞股藍(lán)皂苷45 mg)]；臨床用藥劑量：一次1袋，一日3次；本研究試驗(yàn)動物使用劑量為文獻(xiàn)報道常規(guī)試驗(yàn)劑量[10]。藥物以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液稀釋，4 ℃保存。

1.2 動物及飼料

SPF級C57BL/6J小鼠，體重16～18 g，雄性，購自南通大學(xué)動物中心(許可證號：SCXK(蘇)2014-0001)，所有動物實(shí)驗(yàn)均符合動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。高脂飼料(編號：TP24200，3.4 kCal/g，其中，蛋白質(zhì)熱量22%，脂肪13%，碳水化合物65%)由南通特洛菲飼料科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀 器

Synergy H1酶聯(lián)免疫檢測儀(美國伯騰儀器有限公司)；Allegra 64R超速控溫離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特有限公司)；Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡(德國卡爾·蔡司股份公司)。

2 方 法

2.1 小鼠模型制備及分組

C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分組。正常對照組小鼠(15只)給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，高脂血癥組小鼠(105只)給予高脂飼料喂養(yǎng)造模。造模4周后檢測血脂指標(biāo)，判斷模型是否成功。將高脂造模小鼠(105只)按血脂水平隨機(jī)分為7組，每組15只，各組飼養(yǎng)條件不變。空白組、模型組，灌胃等體積0.05%CMC-Na溶液；陽性藥組(Lip)，給予阿托伐他汀溶液10 mg/kg；絞股藍(lán)總苷顆粒低、中、高劑量組(L,M,H)，分別給予絞股藍(lán)總苷顆粒90、120、180 mg/kg(以絞股藍(lán)皂苷計)；聯(lián)合組(Lip+H)給予絞股藍(lán)總苷顆粒180 mg/kg+阿托伐他汀10 mg/kg，持續(xù)給藥4周，實(shí)驗(yàn)期間所有動物自由飲水及飲食。

2.2 生理狀況、攝食量、體重變化

每日監(jiān)測小鼠健康情況，包括精神狀況、日?；顒?、進(jìn)水情況及毛發(fā)顏色等。每天定量給予飼料，并記錄剩余飼料，每周稱量小鼠體重。平均攝食量=(給予飼料-剩余飼料)/小鼠只數(shù),平均體重=各組小鼠體重之和/小鼠只數(shù)。

2.3 樣本采集與保存

2.3.1 血清樣本 給藥4周后，小鼠禁食12 h，眼眶取血0.2～0.3 mL，3 000 r/min 離心10 min分離血清樣本，-80 ℃保存。

2.3.2 組織樣本 給藥4周后，小鼠禁食12 h，處死后立即取出肝及腹部、附睪、腎周脂肪組織，生理鹽水沖洗，紗布吸干后稱重，-80 ℃保存。

2.4 血清生化指標(biāo)的測定

給藥4周后，檢測血清TC、TG、HDL-C、LDL-C，ApoB含量；肝功能指標(biāo)ALT、AST含量。

2.5 小鼠胰腺組織蘇木精-伊紅(HE)染色法

小鼠處理后，將福爾馬林固定好的胰腺組織經(jīng)石蠟切片后，HE染色，然后置于顯微鏡鏡下，觀察胰腺組織變化。

2.6 肝臟TC代謝相關(guān)基因表達(dá)水平檢測

取各組肝組織100 mg，液氮中磨碎，加入緩沖液裂解，提取總RNA。用RT-PCR法測定相關(guān)基因表達(dá)量(表1)。

Table 1 Quantitative real-time PCR primers

GeneForward primerReverse primerLXRα5′-TGGAGACATCTCGGAGGTAC-3′5′-AGCAATGAGCAAGGCAAACT-3′ABCA15′-AAGAACCAGCTGGGAACAGG-3′5′-CAGCGTGTCACTCTCATGGT-3′CYP7A15′-GACATCATAGCTCTTTACCCACA-3′5′-GGTAGTCTTTGTCTTCCCGTTTT-3′LDLR5′-TCAGGCTAAAGGTCAGCTCC-3′5′-TCTCATTTCCTCTGCCAGCA-3′ABCG55′-AGCAAGGAACGGGAAATAGA-3′5′-CAGGAGAACACCCAGTTTAGAG-3′ABCG85′-GATACAGCCGCCCTCTTGTT-3′5′-GCCCGTCTTCCAGTTCATAG-3′SR-BI5′-CTCCCATCCTCACTTCCTCAA-3′5′-AATGCCTGCGACAGATTTCA-3′SREBP-25′-GTCCTGAGCGTCTTTGTGA-3′5′-CCAGGCAGGTTTGTAGGTT-3′

2.7 肝臟TC代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測

取各組肝組織100 mg，用組織裂解液裂解并勻漿，然后在4 ℃以15 000 r/min離心30 min，取上清液作樣本，用Western blot檢測LXRα和ABCA1 蛋白表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié) 果

3.1 絞股藍(lán)總苷顆粒對小鼠體重、攝食量及相對臟器質(zhì)量的影響

結(jié)合攝食量和體重變化觀察(表2、表3)，高脂飼料喂養(yǎng)4周后，模型組小鼠較空白組攝食量差異不大，但小鼠體重明顯上升，第5周后模型組小鼠體重較空白組具有顯著性差異(P<0.05)。給藥后，絞股藍(lán)總苷顆粒低、中、高劑量組小鼠較模型組小鼠體重均有下降趨勢，在第7、第8周時各組小鼠體重較模型組均顯著性降低(P<0.05)。如表4所示，小鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)后，模型組小鼠的肝、腎周脂肪、附睪脂肪、腹部脂肪較空白組重量顯著增加(P<0.05)。給藥干預(yù)后，聯(lián)合組小鼠的腹部脂肪和附睪脂肪重量以及絞股藍(lán)總苷顆粒低劑量組和高劑量組小鼠的腹部脂肪重量較模型組明顯降低(P<0.05)。以上結(jié)果提示絞股藍(lán)總苷顆?？梢愿纳聘咧嬍硨?dǎo)致的小鼠內(nèi)臟脂肪沉積。

Table 2 Weekly average food intake of C57BL/6J mice (n=8- 12)

GroupFood intake/g12345678 weekBlank13.114.316.817.312.614.513.59.7Model11.514.116.518.217.213.713.112.1Lip10.013.917.817.915.312.810.912.9L10.715.217.318.916.310.511.511.8M11.111.518.017.118.413.511.38.8H13.313.119.018.615.68.911.510.9Lip+H11.813.315.118.015.59.911.910.0

Lip:10 mg/(kg·d) of Lipitor;L:90 mg/(kg·d) of gypenosides granules;M:120 mg/(kg·d) of gypenosides granules;H:180 mg/(kg·d) of gypenosides granules;Lip+H:180 mg/(kg·d) of gypenosides granules and 10 mg/(kg·d) of lipitor

GroupBody weight/g12345678 weekBlank22.73±1.3523.26±1.5524.18±1.6524.84±1.8024.89±2.0424.76±1.4425.55±1.2525.55±1.36Model23.97±1.2324.54±1.9325.81±1.7626.6±1.3326.33±1.74#26.9±1.69#28.4±1.76#28.4±1.31##Lip22.95±1.5523.22±1.8025.22±1.5326.61±1.3926.18±1.2326.17±2.0027.58±2.1627.58±2.37L23.28±1.124.09±2.0724.98±1.5625.78±2.2725.39±2.5924.83±2.86?24.03±2.01?24.03±2.37?M23.6±1.7123.38±1.3925.02±1.5426.1±1.6326.23±1.8326.23±2.2626.44±2.89?26.44±2.76?H24.1±0.8823.87±1.3824.99±1.7026.97±1.5726.33±1.2626.2±1.6127.71±0.83?27.71±0.85?Lip+H23.95±1.2924.71±1.2225.02±1.8526.37±1.9326.44±1.426.42±3.5324.8±3.9424.8±3.78

#P<0.05,##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

GroupLiver/gBelly fat/gPerirenal fat/gEpididymis fat/gBlank0.91±0.160.09±0.020.05±0.000.47±0.12Model1.14±0.19#0.20±0.09#0.06±0.02#0.76±0.25#Lip1.13±0.210.16±0.090.08±0.030.86±0.33L1.02±0.090.11±0.05?0.06±0.020.67±0.22M1.08±0.180.17±0.140.06±0.020.67±0.19H1.12±0.230.12±0.04?0.08±0.030.68±0.07Lip+H1.11±0.230.12±0.08?0.07±0.030.53±0.28?

#P<0.05,##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

3.2 絞股藍(lán)總苷顆粒對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠產(chǎn)生高脂血癥，藥物干預(yù)四周后，檢測C57BL/6J小鼠血清生化指標(biāo)，結(jié)果如表5所示。與模型組比較，藥物干預(yù)后均能明顯降低小鼠血清TC含量(P<0.05)，其中聯(lián)合組的藥效優(yōu)于絞股藍(lán)總苷顆粒高劑量組及陽性藥組。絞股藍(lán)總苷顆粒低、中、高劑量組及聯(lián)合組均有升高HDL-C、降低LDL-C水平的作用趨勢，陽性藥組較模型組能明顯升高小鼠血清HDL-C含量(P<0.05)。

肝功能相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，持續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料導(dǎo)致模型組小鼠血清ALT、AST水平顯著升高，誘發(fā)肝損傷。給予絞股藍(lán)總苷顆粒干預(yù)后，與模型組相比，絞股藍(lán)總苷顆粒低、中、高劑量組均能明顯降低血清AST水平(P<0.05)。根據(jù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)總苷顆粒低劑量組及聯(lián)合組較模型組ApoB含量有所降低，但無顯著性差異；而陽性藥組較模型組能明顯減少小鼠ApoB的分泌(P<0.05)。以上結(jié)果提示絞股藍(lán)總苷顆粒能夠改善高脂血癥小鼠血清TC指標(biāo)，降低血清轉(zhuǎn)氨酶含量，有效緩解肝損傷。

GroupTC/(mmol/L)TG/(mmol/L)HDL-L/(mmol/L)LDL-L/(mmol/L)AST/(U/L)ALT/(U/L)APOB/(mmol/L)Blank4.02±0.571.50±0.345.60±0.680.38±0.3243.68±9.0715.27±4.13161.21±24.35Model6.91±1.09??1.45±0.364.62±0.87?1.33±0.78??78.17±18.08??23.78±6.07?243.46±23.48??Lip5.20±0.95##1.51±0.416.65±0.99##1.30±0.1955.53±14.69#23.66±5.77109.00±25.80##L4.86±0.44##1.47±0.275.20±0.481.39±0.2149.82±14.73##28.00±3.75228.39±16.33M5.20±0.60##1.53±0.545.20±0.701.37±0.2240.79±8.16##25.58±6.84279.21±25.50H5.88±1.701.54±0.245.31±0.531.32±0.2242.29±10.84##23.97±5.71306.43±20.79Lip+H4.68±0.56##1.14±0.12?5.53±0.971.16±0.1958.76±8.9922.81±3.50229.91±26.91

#P<0.05,##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

3.3 肝臟HE染色

各組小鼠肝臟HE染色結(jié)果如圖1所示。空白組小鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列有序。高脂飲食誘導(dǎo)后，模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)空泡，并伴有脂滴蓄積，肝索結(jié)構(gòu)不清晰。給予藥物干預(yù)后，絞股藍(lán)總苷顆粒低、中、高劑量組較模型組脂滴明顯減少，空泡消失；聯(lián)合組脂滴減少，肝細(xì)胞排列較整齊，肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞狀態(tài)趨于正常肝細(xì)胞；陽性藥組表現(xiàn)出與聯(lián)合組類似的藥效。以上結(jié)果說明絞股藍(lán)總苷顆粒對受損小鼠肝細(xì)胞有保護(hù)和促進(jìn)修復(fù)作用。

Figure 1 Effect of gypenosides granules on liver in C57BL/6J mice by HE staining (×200)

3.4 絞股藍(lán)總苷顆粒對小鼠肝臟膽固醇代謝相關(guān)蛋白與基因表達(dá)的影響

為探究絞股藍(lán)總苷顆粒降脂的作用機(jī)制，考察小鼠肝臟膽固醇代謝關(guān)鍵因子蛋白、基因表達(dá)水平。如圖2所示，經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)后，模型組較空白組LXRα蛋白量明顯上升(P<0.05)、ABCA1的蛋白表達(dá)量則恰恰相反(P<0.05)。給藥干預(yù)后，絞股藍(lán)總苷顆粒低劑量組LXRα蛋白表達(dá)量較模型組呈下降趨勢，但無顯著性差異；ABCA1的蛋白表達(dá)卻顯著上調(diào)(P<0.05)。

肝臟TC代謝相關(guān)基因表達(dá)如圖3所示。相比空白組，模型組LXRα基因表達(dá)量明顯上升，ABCA1、CYP7A1、SR-BΙ、LDLR及SREBP-2的基因表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。給藥干預(yù)后，LXRα基因表達(dá)量具有一定下降趨勢；絞股藍(lán)總苷顆粒低劑量組ABCA1、CYP7A1、SR-BΙ的基因表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，LDLR及SREBP-2基因表達(dá)量呈增長趨勢，但與模型組相比無顯著性差異。

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食成功誘導(dǎo)小鼠高脂血癥模型，模型小鼠血清膽固醇含量顯著升高，同時出現(xiàn)肝臟損傷癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)總苷顆粒低、中劑量組均可以顯著改善機(jī)體膽固醇水平，聯(lián)合組較陽性藥組以及絞股藍(lán)總苷顆粒高劑量組降脂效果更顯著，并且有效緩解肝臟損傷，降低血清轉(zhuǎn)氨酶含量。

脂質(zhì)異位是指脂質(zhì)在肝臟、肌肉、β細(xì)胞、心以及內(nèi)皮細(xì)胞等非脂肪細(xì)胞的沉積。腹內(nèi)脂肪與HDL-C呈負(fù)相關(guān)，與LDL-C呈正相關(guān)，過度積累的內(nèi)臟脂肪組織可釋放大量游離脂肪酸(FFA)進(jìn)入血液循環(huán)，促使胰腺、肝臟及骨骼肌等組織吸收過多的FFA，損害胰島素依賴的代謝過程，內(nèi)臟脂肪還可分泌炎癥因子，影響體內(nèi)其他代謝過程，引發(fā)糖尿病等其他并發(fā)癥[11]。他汀類在高劑量使用時，也可能會增加病人患糖尿病的風(fēng)險[12]。已經(jīng)有研究表明絞股藍(lán)可以降低超重和胰島素抵抗風(fēng)險，具有潛在的降糖效果[13-14]。本研究顯示絞股藍(lán)總苷顆?？蓽p少小鼠腹部脂肪蓄積量，與他汀聯(lián)用后可防止體重增加以及相關(guān)并發(fā)癥的產(chǎn)生。

#P<0.05vsblank group;*P<0.05vsmodel group

#P<0.05vsblank group;*P<0.05vsmodel group

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷干預(yù)后對天冬氨酸AST轉(zhuǎn)氨酶有特定的效果，優(yōu)于陽性藥羅格列酮、辛伐他汀和非諾貝特，并對膽汁酸通路產(chǎn)生影響，推斷絞股藍(lán)皂苷可能是通過促進(jìn)肝臟膽汁酸的合成起到防治肝損傷的作用[15]。本研究結(jié)果顯示，絞股藍(lán)總苷顆粒還可減少血清中AST含量，修復(fù)小鼠受損的肝細(xì)胞，提示絞股藍(lán)總苷顆?？梢詼p輕高脂誘導(dǎo)的肝臟損傷，具有潛在的護(hù)肝作用。因此推測絞股藍(lán)總苷顆粒與他汀聯(lián)用后，可顯著逆轉(zhuǎn)他汀導(dǎo)致的轉(zhuǎn)氨酶升高，減少其不良反應(yīng)發(fā)生率。

在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，TC經(jīng)肝外組織和巨噬細(xì)胞流出胞外，經(jīng)HDL攝取后，與細(xì)胞表面的ABCA1相結(jié)合，再在LCAT的作用下，HDL游離膽固醇酯化后形成膽固醇酯，然后SR-BΙ將膽固醇酯重新轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟代謝為膽汁酸，排出體外[16-17]。激活CYP7A1能夠調(diào)節(jié)膽汁酸的代謝與合成，減少TC在肝臟的堆積[18]。由此可見，ABCA1、CYP7A1和SR-BΙ對調(diào)節(jié)TC代謝具有重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)總苷顆粒不僅能夠促進(jìn)ABCA1的蛋白表達(dá)，還能上調(diào)ABCA1、CYP7A1和SR-BΙ的基因表達(dá)，因此，推測絞股藍(lán)總苷顆粒能通過影響ABCA1、CYP7A1和SR-BΙ的活性參與肝臟TC代謝，從而降低機(jī)體的TC含量。此外，文獻(xiàn)研究證實(shí)LXRα可通過調(diào)節(jié)ABCA1、ABCG5/G8及CYP7A1的活性來影響膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)[19]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)絞股藍(lán)總苷顆粒干預(yù)后，LXRα呈下降趨勢，ABCA1和CYP7A1表達(dá)量明顯上調(diào)，絞股藍(lán)總苷顆粒降TC的機(jī)制可能是獨(dú)立調(diào)節(jié)LXRα及ABCA1等靶點(diǎn)?，F(xiàn)有諸多報道如法尼酯受體(FXR)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)等其他受體也能通過作用于ABCA1、CYP7A1或其他相關(guān)蛋白從而調(diào)節(jié)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[20-21]。因此，絞股藍(lán)總苷顆粒是如何調(diào)節(jié)ABCA1、CYP7A1等肝臟TC代謝相關(guān)蛋白的活性來維持體內(nèi)TC的穩(wěn)態(tài)還需進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)陽性藥阿托伐他汀對ABCA1、ABCG5/G8及CYP7A1的影響趨勢與絞股藍(lán)總苷顆粒低劑量組類似，據(jù)報道阿托伐他汀通過抑制小鼠肝臟和腸道的FXR信號通路，誘導(dǎo)膽汁酸合成酶CYP7A1[22]，與絞股藍(lán)總苷顆粒聯(lián)用后可協(xié)同發(fā)揮降脂效果。

本研究證實(shí)絞股藍(lán)總苷顆粒對高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥小鼠有一定的治療作用，與他汀聯(lián)用后效果更佳，并可改善他汀升高轉(zhuǎn)氨酶的副作用，改善肝功能。后續(xù)將繼續(xù)深入探索絞股藍(lán)總苷顆粒與他汀聯(lián)用的機(jī)制，明確最佳聯(lián)用劑量，為絞股藍(lán)總苷顆粒在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。