曾令勇 黎榮 黃俊 劉亮 余輝 錢冉

(1咸寧市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 咸寧 437100；2湖北科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)診斷教研室)

研究表明心肌梗死引起的心肌細(xì)胞凋亡是引起心肌梗死后心室重構(gòu)和心力衰竭的主要原因，抑制心肌細(xì)胞凋亡可顯著阻斷心肌梗死的發(fā)生〔1，2〕。miRNAs是一種非編碼RNA分子，可以和下游靶基因結(jié)合，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄或降解靶基因，從而對(duì)細(xì)胞的生長、增殖、分化、遷移、凋亡等生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控〔3〕。miR-145和血管平滑肌細(xì)胞表型分化關(guān)系密切，研究發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征患者血漿miR-145水平下降〔4〕，miR-145與缺氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷有關(guān)〔5〕。但miR-145在心肌梗死中的表達(dá)及其對(duì)心肌梗死的作用機(jī)制研究不多。本文對(duì)miR-145在心肌梗死大鼠心肌組織中的表達(dá)及其在心肌梗死中的作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)、雄性、健康、SD大鼠258只，體重180～220 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2008-0016。主要試劑：兔抗磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)單克隆抗體、兔抗磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)單克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2單克隆抗體，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔抗體(美國Epitmics公司)，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、Trizol試劑盒、RT-PCR試劑盒(美國Tocris公司)，miR-145寡核苷酸模擬物(mimics)和miR-145 mimics陰性對(duì)照(廣州銳博生物科技有限公司合成)，TUNEL檢測試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)等。

1.2心肌梗死模型建立 通過冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎建立心肌梗死模型：水合氯醛麻醉成功后，剔除大鼠胸部和頸部毛發(fā)，碘伏溶液消毒頸部皮膚并做長1 cm切口，暴露氣管、連接呼吸機(jī)；胸部皮膚消毒后在左側(cè)第4根肋骨作為手術(shù)切口，剝離皮膚，暴露心臟，找到冠狀動(dòng)脈左前降支并結(jié)扎，心電圖顯示ST段弓背向上抬高，左心室變白為心肌梗死模型建立成功。

1.3miR-145水平測定 取78只大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和心肌梗死組，每組39只，對(duì)照組給予假手術(shù)處理(只進(jìn)行冠狀動(dòng)脈左前降支穿線，不結(jié)扎)，心肌梗死組建立心肌梗死動(dòng)物模型。分別在建模1 d、3 d、7 d每組各處死13只大鼠，取大鼠心肌組織(心肌梗死組大鼠取梗死區(qū)心肌組織)，進(jìn)行心肌組織中miR-145水平測定。采用Trizol試劑盒提取各大鼠心肌組織總RNA，檢測RNA純度，采用RT-PCR法測定大鼠心肌組織miR-145表達(dá)：將RNA逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)。miR-145相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.4大鼠慢病毒轉(zhuǎn)染 另取180只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、心肌梗死組、陰性對(duì)照組和miR-145組，每組45只，心肌梗死組、陰性對(duì)照組和miR-145組大鼠建立心肌梗死模型(方法同上)。miR-145組大鼠心肌組織局部注射攜帶miR-145 mimics慢病毒(4×107個(gè))，陰性對(duì)照組大鼠心肌組織局部注射攜帶綠色熒光蛋白(GFP)慢病毒空載體(miR-145 mimics陰性對(duì)照，4×107個(gè))，心肌梗死組大鼠和假手術(shù)組大鼠心肌組織局部注射等量生理鹽水，每天1次，共1 w。治療結(jié)束后，假手術(shù)組、心肌梗死組、陰性對(duì)照組和miR-145組各分3個(gè)亞組，每組中每個(gè)亞組分別為15只、14只、13只、14只大鼠。一個(gè)亞組大鼠用于心功能檢查和心肌梗死面積測定；一個(gè)亞組用于心肌細(xì)胞凋亡測定；一個(gè)亞組用于心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白和mRNA水平測定。

1.5各組大鼠心功能檢查 治療結(jié)束后，水合氯醛麻醉，采用心臟彩超檢查，并記錄各大鼠的左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左心室長軸縮短分?jǐn)?shù)(FS)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)等心功能指標(biāo)。

1.6各組大鼠心肌梗死面積測定 上述大鼠心功能檢查后處死大鼠，取心臟組織，將大鼠心臟沿橫軸方向在心尖到結(jié)扎點(diǎn)之間進(jìn)行切片，切片厚1 mm，進(jìn)行TTC染色，紅色心肌組織為正常心肌組織，白色心肌組織為梗死心肌組織，拍照后采用IMAGE PRO圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算心肌梗死面積占心肌面積的百分?jǐn)?shù)。

1.7各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡測定 取大鼠心肌組織，石蠟包埋后進(jìn)行切片，采用TUNEL法測定心肌凋亡指數(shù)(具體方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)，二脒基苯基吲哚染色后，凋亡細(xì)胞呈棕黃色，在200倍光鏡下計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8各組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白水平測定 取各大鼠心肌組織，勻漿，加入細(xì)胞裂解液裂解30 min，提取心肌組織總蛋白，采用BCA測定心肌組織蛋白濃度，采用Western印跡法測定心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白水平，一抗為兔抗PI3K單克隆抗體、兔抗p-AKT單克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2單克隆抗體，GAPDH單克隆抗體為內(nèi)參照，PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量=PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.9各組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2 mRNA水平測定 采用RT-PCR測定各組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2 mRNA水平，具體方法同心肌組織miR-145表達(dá)量測定。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠存活情況 假手術(shù)組大鼠存活45只，心肌梗死組大鼠建模成功并存活42只，陰性對(duì)照組大鼠建模成功并存活40只，miR-145組大鼠建模成功并存活42只。

2.2不同時(shí)間點(diǎn)心肌梗死大鼠梗死區(qū)心肌組織中miR-145水平 建模1、3、7 d，心肌梗死組miR-145水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.001)。見表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)心肌梗死組和對(duì)照組心肌組織中miR-145水平比較

2.3各組心肌組織中miR-145表達(dá)量及大鼠心臟功能比較 與假手術(shù)組比較，心肌梗死組和陰性對(duì)照組及miR-145組miR-145相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與心肌梗死組和陰性對(duì)照組比較，miR-145組miR-145相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；心肌梗死組和陰性對(duì)照組miR-145相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，心肌梗死組、陰性對(duì)照組LVDs和LVDd顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)S和LVEF顯著降低(P<0.05)；與心肌梗死組和陰性對(duì)照組比較，miR-145組大鼠LVDs和LVDd顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)S和LVEF顯著升高(P<0.05)；心肌梗死組和陰性對(duì)照組大鼠LVDs、LVDd、FS、LVEF比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心臟功能及心肌組織中miR-145相對(duì)表達(dá)量、心肌梗死面積和凋亡指數(shù)比較

與假手術(shù)組比較:1)P<0.05;與心肌梗死組比較:2)P<0.05;與陰性對(duì)照組比較:3)P<0.05;下表同

2.4各組心肌梗死面積和凋亡指數(shù)比較 假手術(shù)組無心肌梗死。與假手術(shù)組比較，心肌梗死組和陰性對(duì)照組及miR-145組心肌凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與心肌梗死組和陰性對(duì)照組比較，miR-145組心肌梗死面積和凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.05)；心肌梗死組和陰性對(duì)照組心肌梗死面積和凋亡指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1和圖2。

2.5各組心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白及mRNA水平比較 與假手術(shù)組比較，心肌梗死組和陰性對(duì)照組及miR-145組Bax蛋白水平及mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(均P<0.05)，PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白水平及mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(均P<0.05)；與心肌梗死組和陰性對(duì)照組比較，miR-145組Bax蛋白水平及mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(均P<0.05)，PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白水平及mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(均P<0.05)；心肌梗死組和陰性對(duì)照組PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白水平及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖3。

圖1 各組大鼠心肌梗死面積

箭頭所示為凋亡細(xì)胞圖2 各組大鼠心肌組織TUNEL染色(×200)

組別nPI3Kp-AKTBaxBcl-2PI3K mRNAp-AKT mRNABax mRNABcl-2 mRNA假手術(shù)組150.43±0.060.91±0.130.16±0.030.49±0.161.00±0.011.00±0.011.00±0.031.00±0.02心肌梗死組140.16±0.031)0.18±0.051)0.94±0.151)0.13±0.041)0.33±0.121)0.22±0.041)3.52±0.761)0.28±0.091)陰性對(duì)照組130.15±0.021)0.17±0.061)0.95±0.131)0.12±0.061)0.34±0.131)0.23±0.031)3.47±0.681)0.26±0.081)miR-145組140.31±0.051)2)3)0.65±0.071)2)3)0.37±0.071)2)3)0.27±0.111)2)3)0.52±0.211)2)3)0.48±0.161)2)3)1.94±0.321)2)3)0.61±0.151)2)3)F值132.991261.889207.74738.46077.192274.83777.902187.764P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

A:假手術(shù)組，B:心肌梗死組，C:陰性對(duì)照組，D:miR-145組圖3 各組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白Western印跡電泳

3 討 論

miRNAs為一類高度保守的小RNA，長18～25 nt，可以和靶基因3′-UTR區(qū)域結(jié)合，抑制靶基因翻譯，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等，研究發(fā)現(xiàn)miRNAs和心肌缺血再灌注損傷、心肌梗死、心臟重構(gòu)、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切〔6〕。miR-145位于人類染色體5q32上，有23個(gè)核苷酸組成，miR-145在血管平滑肌中高度表達(dá)，參與血管平滑肌的增殖和收縮表型的維持〔7，8〕，和動(dòng)脈血管平滑肌的增殖和遷移關(guān)系密切〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-145在心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，如姜春玲〔10〕研究發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征患者外周血單核細(xì)胞miR-145水平下降。Xu等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)miR-145過表達(dá)可以通過靶向細(xì)胞程序性死亡基因(PDCD)4預(yù)防大鼠心肌梗死。Zhang等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死的發(fā)生與血漿miR145水平降低有關(guān)，血漿miR145水平可用于預(yù)測心臟功能和心力衰竭的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Higashi等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)miR-145可通過心肌細(xì)胞自噬修復(fù)梗死的心肌組織。但miR-145在心肌梗死心肌組織中的表達(dá)及其對(duì)心肌梗死的影響尚不十分清楚，本研究建立心肌梗死大鼠模型，發(fā)現(xiàn)心肌梗死大鼠心肌組織中miR-145水平下降，向梗死心肌組織中注射miR-145可減少心肌梗死面積，降低心肌凋亡指數(shù)，改善心功能，本研究結(jié)果提示miR-145參與心肌梗死的發(fā)生發(fā)展過程，miR-145可通過降低心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)心肌的作用。

細(xì)胞的凋亡受多種信號(hào)通路調(diào)控，PI3K/AKT具有抗凋亡通路之稱，是調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中的一種〔14〕，PI3K/AKT信號(hào)通路可通過調(diào)控其下游的Bcl-2和Bax等多種靶蛋白的表達(dá)發(fā)揮對(duì)細(xì)胞生長、分化、凋亡、侵襲、遷移及血管形成等病理生理過程〔15，16〕。在心肌梗死中PI3K/AKT信號(hào)通路失活，激活PI3K/AKT信號(hào)通路可抑制心肌細(xì)胞凋亡〔17～19〕。在心肌缺血再灌注中，PI3K/AKT信號(hào)通路的激活及其對(duì)Bcl-2和Bax的調(diào)控可減少心肌細(xì)胞凋亡〔20，21〕。miR-145的生物學(xué)作用與PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)系也比較密切，有研究發(fā)現(xiàn)miR-145通過PI3K/AKT信號(hào)通路卵巢上皮癌的發(fā)生發(fā)展〔22〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌梗死大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT、Bcl-2水平降低，Bax水平升高，對(duì)梗死心肌組織中注射miR-145后大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT、Bcl-2水平升高，Bax水平降低。本研究結(jié)果表明miR-145可能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路及調(diào)控PI3K/AKT下游Bcl-2和Bax靶蛋白水平發(fā)揮對(duì)心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用。