任路平 王娜 于賢 劉娜 陳樹春 宋光耀

(河北省人民醫(yī)院內分泌科，河北 石家莊 050000)

隨著非酒精性脂肪肝發(fā)生率逐年升高，其發(fā)病機制已得到研究者的重視。近年，內質網應激(ERS)在脂肪肝發(fā)生發(fā)展中的作用已被證實〔1，2〕，激活轉錄因子(ATF)4是內質網應激時非折疊蛋白反應的下游轉錄因子〔3〕，既往研究發(fā)現(xiàn)ATF-4在脂代謝調節(jié)中發(fā)揮作用〔4，5〕，但是尚缺少ATF-4對肝細胞內脂質代謝直接影響的相關研究。本研究通過觀察ATF-4過表達對HepG2細胞脂質沉積及脂質從頭合成的影響，探討ATF-4在肝細胞內脂代謝中可能的介導作用。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng) 人肝腫瘤系HepG2細胞(江蘇省江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術有限公司)。MEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，配比為10%胎牛血清(FBS)+1%非必需氨基酸(NEAA)+1%雙抗+88% MEM培養(yǎng)基。HepG2細胞貼壁超過培養(yǎng)瓶底面積80%以上時進行細胞傳代。棄去原有培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)(復溫至室溫)3～5 ml洗滌細胞2次，加入0.25%的胰蛋白酶消化液1 ml，消化2～3 min后細胞發(fā)生形態(tài)改變，多角形貼壁細胞近乎縮成圓形，胞質回縮，細胞間出現(xiàn)縫隙，此時加入1 ml新鮮MEM培養(yǎng)基(復溫至室溫)終止消化。經吹打混勻后得到細胞懸液，接種到新的培養(yǎng)瓶中，按1∶2或1∶3比例進行傳代，加新鮮培養(yǎng)基至5 ml，放置于5% CO2、37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中。

1.2細胞轉染 制備DNA-Lipofectamine 2000復合物:①用50 μl無血清培養(yǎng)基稀釋DNA(0.8 g)，輕輕混勻；②Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)使用前輕輕混勻，用48 μl無血清培養(yǎng)基稀釋2 μl Lipofectamine 2000，輕輕混勻，室溫孵育5 min；③將①+②的液體加在一起，輕輕混勻，室溫孵育20 min，形成DNA-Lipofectamine 2000復合物；④將100 μl DNA-Lipofectamine 2000復合物加入培養(yǎng)板中，輕輕前后搖勻；⑤放入37℃孵箱中培養(yǎng)24～48 h，待細胞長滿后收集細胞，用于轉染目的蛋白的測定。

1.3細胞分組 根據不同處理方法將細胞進行分組：未轉染組(普通培養(yǎng)基)，陰性對照組(普通培養(yǎng)基+轉染空白對照質粒)及 ATF-4上調組(ATF-4+組，普通培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細胞+轉染針對上調ATF-4質粒)。

1.4HepG2細胞三酰甘油測定 將各組培養(yǎng)后的HepG2細胞懸液離心 10 min(1 000 r/min)，留細胞沉淀，以GPO-PAP法測定細胞內三酰甘油含量。

1.5HepG2細胞油紅O染色 應用10%中性甲醛固定細胞，去離子水稀釋油紅儲存液，染色2 h，沖洗染液后照相。

1.6基因測定 Trizol法提取總RNA，采用實時熒光定量 PCR(RT-PCR)測定肝細胞內脂代謝相關基因的mRNA表達，包括固醇調節(jié)元素結合蛋白(SREBP)-1c、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和硬酯酰輔酶A去飽和酶(SCD)-1。引物設計見表1。

表1 脂代謝相關酶的基因檢測引物序列

1.7蛋白表達測定 HepG2細胞蛋白經提取后采用BCA法定量，應用Western印跡方法測定蛋白。蛋白經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳完成后，參照蛋白Marker分離條帶，切下含目的蛋白的凝膠，β-actin分子量43 kD，SCD-1、ACC，F(xiàn)AS分子量分別為37、288、48 kD。將聚偏氟乙烯(PVDF)膜切成與凝膠同等大小，轉膜、封閉后加入抗體(1∶1 000～2 000稀釋)，洗膜后加入二抗(1∶10 000 稀釋)孵育?；瘜W發(fā)光，顯影，定影。將定影后的X線膠片于凝膠成像系統(tǒng)成像，UVP軟件進行分析。結果用目的蛋白條帶的IOD值與β-actin條帶的IOD值的比值表示。FAS抗體：Santa Cruz公司，ATF-4、SCD-1和ACC抗體：Cell Signal公司，β-actin抗體：SAB公司。

1.8統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.0軟件，行完全隨機設計單因素方差分析。

2 結 果

2.1轉染ATF-4過表達質粒對ATF-4的影響 ATF-4+組ATF-4的表達水平(2.35±0.31)比未轉染組(1.00±0.12)、陰性對照組(1.11±0.19)明顯升高(均P<0.01)，見圖1。

2.2轉染ATF-4過表達質粒對HepG2細胞脂質沉積的影響 與未轉染組相比，轉染ATF-4過表達質粒的HepG2細胞TG含量升高40%，差異有統(tǒng)計學意義〔未轉染組(2.31±0.39)μmol/g,陰性對照組(2.43±0.21)μmol/g,ATF4+組(3.36±0.45)μmol/g，P<0.01〕，油紅O染色示脂滴亦顯著增多，見圖2。

2.3轉染ATF-4過表達質粒對脂質從頭合成相關因子基因表達的影響 與未轉染組和陰性對照組相比，ATF-4+組SREBP-1c基因表達明顯增加(P<0.01)，ACC、FAS、SCD-1基因表達明顯增加(均P<0.05)，見表2。

圖1 轉染ATF-4過表達質粒后ATF-4蛋白表達變化

圖2 轉染ATF-4過表達質粒對HepG2細胞脂質沉積的影響(×400)

組別SREBP-1cACCFASSCD-1未轉染組1.00±0.091.00±0.141.00±0.211.00±0.25陰性對照組1.03±0.111.12±0.231.05±0.091.16±0.09ATF4+組2.47±0.391)2.69±0.432)2.07±0.202)3.12±0.512)

與未轉染組及陰性對照組比較：1)P<0.01,2)P<0.05

2.4轉染ATF-4過表達質粒對脂質從頭合成相關因子蛋白表達的影響 與未轉染組和陰性對照組相比，ATF-4+組的ACC、FAS、SCD-1的蛋白表達顯著增加(ACC蛋白表達：未轉染組1.00±0.08，陰性對照組0.98±0.09，ATF4+組1.21±0.11；FAS蛋白表達：未轉染組1.00±0.07，陰性對照組0.96±0.13，ATF4+組1.26±0.14；SCD-1蛋白表達：未轉染組1.00±0.21，陰性對照組1.04±0.16，ATF4+組1.35±0.16；均P<0.05),見圖3。

圖3 轉染ATF-4過表達質粒對ACC，F(xiàn)AS，SCD-1蛋白表達的影響

3 討 論

本課題組前期研究表明，ERS參與肝臟脂質沉積的介導作用〔6，7〕。ATF-4是ERS非折疊蛋白反應通路之一磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶(PERK)-真核細胞轉錄起始因子α亞單位(eIF-2α)-ATF-4通路的下游轉錄因子〔8〕，是基本亮氨酸拉鏈蛋白家族之一，屬于環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)家族〔9〕。ATF-4在很多組織包括大腦、心臟、脂肪組織和肝臟等中均有表達。既往研究表明，高脂、高果糖喂養(yǎng)小鼠誘導脂肪肝后，肝內均存在PERK/eIF-2α/ATF-4通路激活〔10〕。而近年也有研究表明ATF-4可能對脂代謝具有調節(jié)作用，并參與到非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中〔11〕。一個轉基因小鼠模型表明PERK/eIF-2α/ATF-4通路在肝臟脂質合成的調節(jié)中發(fā)揮作用，ATF-4基因敲除可改善高果糖喂養(yǎng)小鼠誘導的高脂血癥〔12〕。研究表明，ATF-4缺失的小鼠可抵抗高脂喂養(yǎng)誘導的肥胖及肝臟脂質沉積〔13〕。但是目前尚缺少ATF-4基因表達變化對肝臟脂質從頭合成直接影響的細胞研究。本實驗將HepG2細胞轉染了過表達的ATF-4的質粒后，結果表明ATF-4基因特異性的變化在肝細胞脂質沉積中發(fā)揮重要作用，證實了PERK-eIF2α-ATF-4通路在調控ERS誘導細胞脂質沉積中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，ATF4過表達可促進SREBP-1c的基因表達。SREBP-1c是調節(jié)脂質從頭合成的一個關鍵上游調控因子，并與肝細胞ERS相關〔14，15〕，而ACC、FAS和SCD-1是脂質從頭合成下游的關鍵酶。有研究應用ERS誘導劑Tg培養(yǎng)HepG2和LO2細胞后引起ERS及細胞內三酰甘油含量增多，同時伴有SREBP-1c、ACC1、FAS的表達增加，而加用SREBP-1c抑制劑4-(2-氨乙基) 苯磺酰氟化物(AEBSF)后，細胞脂質沉積得以改善，ACC1和FAS水平降低，證實了SREBP-1c在肝細胞內對脂質從頭合成的上游調節(jié)作用及其與ERS的相關性〔16〕。以往已有研究發(fā)現(xiàn)PERK-eIF2α-ATF-4通路中的PERK可通過SREBP-1影響脂質從頭合成，小鼠PERK基因敲除后減少了脂質合成上游調控因子SREBP-1基因表達水平〔17〕。本研究證實了PERK-eIF2α-ATF-4通路的下游轉錄因子ATF-4可直接刺激SREBP-1c的基因合成，并進而促進下游脂質從頭合成關鍵酶ACC、FAS和SCD-1的基因和蛋白表達，從而刺激脂質從頭合成。ATF-4刺激脂質從頭合成是其引起肝細胞內脂質沉積的重要機制之一。ATF-4作用于SREBP可能的機制是由于ATF-4缺失導致細胞內蛋白合成減少，抑制了雷帕霉素的哺乳動物靶點(mTOR)通路，抑制了核糖體S6蛋白激酶(S6K)作用，減少脂肪從頭合成〔18〕。

ERS通路具有非常的復雜性和非專一性，細胞內具有復雜的信號網絡關系，而通路中的各個轉錄因子又具有廣泛的生理作用。ATF-4也具有廣泛的生理作用，有研究表明ATF-4可以間接調節(jié)糖脂代謝，ATF-4可以通過對其他轉錄因子的影響促進脂肪因子分泌及胰島素敏感性受損〔19，20〕。

總之，上調HepG2細胞ATF-4后，可以引起三酰甘油沉積，其機制與ATF-4過表達引起脂質從頭合成上游因子SREBP-1c和下游酶類ACC、FAS、SCD-1的表達增加有關。本研究結果證實ATF-4可能介導了非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展，具體的分子機制尚需深入研究。