安立 林英翔 張鴻 逯勇 張曙 華琳

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 北京市呼吸疾病研究所 北京市呼吸與危重癥診治工程技術(shù)研究中心，北京 100020；2首都醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院數(shù)學(xué)與生物信息學(xué)教研室)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一復(fù)雜的多基因疾病。其中，微粒體環(huán)氧化物水解酶(EPHX)1、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)P1都屬于異生物代謝酶基因，主要參與對(duì)香煙煙霧等外來(lái)異生型物質(zhì)、氧化物和反應(yīng)性氧化物的中間產(chǎn)物在肺中的首過(guò)代謝。EPHX1有兩個(gè)常見(jiàn)的突變位點(diǎn)Try113His和His139Arg，分別被稱為慢等位基因和快等位基因，能夠引起酶活性的改變〔1〕。而GSTP1常見(jiàn)的突變位點(diǎn)位于外顯子5(Ile105Val)和外顯子6(Ala114Val)。研究證實(shí)105Ile等位基因較105Val有更高的催化活性〔2〕。近年來(lái)人們對(duì)這兩個(gè)基因與COPD易感性的關(guān)系進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)結(jié)果存在明顯的種族差異〔3～6〕，而在中國(guó)人群中的研究中也有不一致現(xiàn)象，研究多集中于上述幾個(gè)突變位點(diǎn)〔7～9〕。本研究旨在探討在中國(guó)北方漢族人群中EPHX1、GSTP1與COPD發(fā)病及肺功能表型之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2007年10月至2009年3月北京朝陽(yáng)醫(yī)院及各合作醫(yī)院呼吸科門診就診的穩(wěn)定期漢族COPD患者316例(病例組)。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡40～75歲，男女不限；②肺功能檢查符合COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)。且符合應(yīng)用支氣管擴(kuò)張劑后第1秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)≤70%和FEV1≤80%pre；③所有患者處于疾病的穩(wěn)定期，入選前6 w內(nèi)沒(méi)有咳嗽、咳痰或呼吸困難加重；沒(méi)有發(fā)熱；沒(méi)有針對(duì)呼吸癥狀加重的用藥改變；④不伴有以下任何一種疾病或情況：哮喘、過(guò)敏性鼻炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化、神經(jīng)肌肉異常等影響運(yùn)動(dòng)的疾病及精神異常和認(rèn)知障礙。同期在北京朝陽(yáng)醫(yī)院和各合作醫(yī)院的體檢門診及周圍社區(qū)選擇年齡40～75歲，性別匹配的漢族健康對(duì)照者213例。所有的受試者在試驗(yàn)前簽署知情同意書。

1.2DNA的提取及基因分型 所有受試者于采血前均禁食12 h，晨起空腹抽取靜脈血3 ml，經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，離心(3 000 r/min，15 min)分離血漿，低滲法破壞血細(xì)胞沉淀中的紅細(xì)胞，將所得白細(xì)胞沉淀于-80℃保存，用于提取DNA。應(yīng)用Illumina公司提供的BeadXp ress的基因分型平臺(tái)采用等位基因特異性雜交法進(jìn)行EPHX1和GSTP1的SNP檢測(cè)。

1.3SNPs位點(diǎn)的選擇 由于在人類的基因組中天然存在連鎖不平衡(LD)，因此應(yīng)用較少的標(biāo)簽SNPs(Tag SNP)便足以能夠獲取存在于高度連鎖區(qū)域的遺傳變異信息〔10〕。挑選Tag SNPs的步驟如下：首先我們列出在以往文獻(xiàn)中曾經(jīng)報(bào)道的關(guān)于4個(gè)基因中和COPD易感及表型相關(guān)的SNPs位點(diǎn)EPHX1：rs1051740、rs2234922、rs1051741、rs2292558、rs3728042、rs3753661、rs3766934、rs1009668、rs868966、rs2292566、rs1877724、rs2260863、rs3753658；GSTP1：rs1695、rs1799811、rs612020、rs11227884〔3，5，11～15〕。其次，下載HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)亞洲人群〔中國(guó)漢族(CHB)；日本人群(JPT)；選用兩個(gè)人群可以增加Tag SNP的覆蓋度〕的EPHX1和GSTP1兩個(gè)基因的基因型數(shù)據(jù)。使用軟件Haploview(Haploview4.2；release 23；CHB+JPT panel)，在每個(gè)基因中依據(jù)它們自身能夠探及LD區(qū)塊的能力，挑選出可以覆蓋該基因的Tag SNPs，并將其作為背景數(shù)據(jù)庫(kù)。再次，將陽(yáng)性位點(diǎn)強(qiáng)行納入Tag SNPs列表中(EPHX1：rs868966、rs1877724、rs3766934、rs1051740、rs2234922、rs2292558、rs1009668；GSTP1：rs1695)。最后，在pairwise 模型下，設(shè)定r2=0.8，然后運(yùn)行Haploview，計(jì)算出覆蓋整個(gè)基因所需的所有Tag SNPs。

1.4統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)。各SNPs位點(diǎn)與COPD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性采用二分類Logistic 回歸分析，與肺功能表型的相關(guān)性采用直線回歸分析，并對(duì)年齡、性別和吸煙指數(shù)等混雜因素進(jìn)行校正。回歸模型分別采用顯性遺傳模型(AA/AC vs.CC)、隱性遺傳模型(AA vs.AC/CC)和加性遺傳模型(AA vs.AC vs.CC)。對(duì)各SNPs位點(diǎn)與COPD發(fā)病及肺功能表型之間的所有相關(guān)性分析皆進(jìn)行Bonferroni 多重檢驗(yàn)〔16〕。上述檢驗(yàn)均采用全基因組關(guān)聯(lián)分析軟件PLINK1.06來(lái)完成。

2 結(jié) 果

2.1受試者一般臨床資料 根據(jù)基因分型的結(jié)果，病例組最后納入研究的COPD患者為310例，對(duì)照組為203例。兩組FEV1、FEV1%pre、FEV1/FVC、FVC有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。病例組年齡和吸煙指數(shù)顯著高于對(duì)照組，體重指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2EPHX1及GSTP1的基因多態(tài)性與COPD易感性的關(guān)系 兩個(gè)基因13個(gè)SNPs的等位基因頻率分布皆符合Hardy-Weinberg平衡，各SNPs的最小等位基因頻率在病例和對(duì)照組中的分布情況見(jiàn)表2。EPHX1的1個(gè)SNP位點(diǎn)(rs3766934)，GSTP1的1個(gè)SNP位點(diǎn)(rs36211088)的等位基因分布在兩組中有明顯差別(P<0.05)。之后以是否發(fā)病為因變量，以各個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型作為自變量進(jìn)行二分類Logistic回歸分析，并對(duì)年齡、性別和吸煙指數(shù)進(jìn)行校正，結(jié)果顯示：在顯性、隱性和加性遺傳模型下EPHX1的2個(gè)SNPs位點(diǎn)(rs3738040和rs3766934)、GSTP1的1個(gè)SNPs位點(diǎn)(rs36211088)皆與COPD易感性相關(guān)(P<0.05)。經(jīng)Bonferroni多重檢驗(yàn)后各SNPs位點(diǎn)與COPD發(fā)病的相關(guān)性消失，見(jiàn)表3。

表1 研究對(duì)象的臨床特征

表2 兩基因SNP標(biāo)簽物理位置及等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中的分布情況

表3 兩基因各SNPs位點(diǎn)與COPD易感性的相關(guān)性分析

PBon：經(jīng)過(guò)Bonferroni校正后的P值；NA：等位基因頻率太低而無(wú)法進(jìn)行分析；表4、5同

2.3EPHX1和GSTP1的基因多態(tài)性與基線肺功能的關(guān)系 如表4、5所示：在顯性模型下，EPHX1的2個(gè)SNPs位點(diǎn)(rs3738040和rs3766934)、GSTP1的1個(gè)SNP位點(diǎn)(rs36211088)分別與FEV1值和FEV1/FVC值顯著相關(guān)(P<0.05)。經(jīng)Bonferroni多重檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)EPHX1的rs3766934仍然與FEV1和FEV1/FVC顯著相關(guān)(P<0.05)，rs3738040則僅與FEV1/FVC顯著相關(guān)(P<0.05)。即攜帶rs3766934T基因的患者與更高的FEV1和FEV1/FVC值相關(guān)，攜帶rs3738040A的患者僅與更高的FEV1/FVC值相關(guān)。顯性模型下GSTP1的rs36211088仍顯示與基線FEV1明顯相關(guān)(P<0.05)，而與FEV1/FVC的相關(guān)性消失(P>0.05)。

2.4LD特征分析與單體型分析

2.4.1LD分析 將對(duì)照組中各基因所有樣本的基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入HaploView(V4.2)，分析各基因的所有SNPs位點(diǎn)之間的LD特征并用其構(gòu)建出每個(gè)基因的單體型圖(圖1)。EPHX1上的2個(gè)陽(yáng)性位點(diǎn)rs3738040和rs3766934之間處于強(qiáng)連鎖(D′=0.83)。由于GSTP1的位點(diǎn)數(shù)太少，只能看到各SNPs位點(diǎn)間的LD關(guān)系，而無(wú)法構(gòu)建連鎖區(qū)塊。

表4 兩基因各SNPs位點(diǎn)與FEV1的相關(guān)性分析

僅顯示了P<0.1 的SNPs；表5同

表5 兩基因各SNPs位點(diǎn)與FEV1/FVC的相關(guān)性分析

共使用了8個(gè)常見(jiàn)變異位點(diǎn)(common SNP)構(gòu)建了EPHX1的LD圖譜。連鎖區(qū)塊內(nèi)的數(shù)值顯示的是兩兩位點(diǎn)間的D′值。紅色代表D′=1，白色代表D′=0，而中間的過(guò)渡色代表 0

2.4.2單體型分析 應(yīng)用滑動(dòng)窗方法對(duì)相鄰3個(gè)SNPs構(gòu)成的單體型進(jìn)行分析，以探討可能與COPD發(fā)病和肺功能表型相關(guān)的區(qū)域。結(jié)果顯示，在EPHX1基因中CAT和CAA個(gè)單體型與COPD的發(fā)病相關(guān)，其中CAT與COPD發(fā)病更為密切(Pspecific=0.014)。在GSTP1基因中AGG與COPD易感性密切相關(guān)(Pspecific=0.010，Pglobal=0.036)。見(jiàn)表6。在與肺功能表型相關(guān)的分析中發(fā)現(xiàn)EPHX1基因中有4個(gè)單體型(GGA、GAA、AAG、AGA)分別與FEV1和FEV1/FVC顯著相關(guān)(P<0.05)。GSTP1中有1個(gè)單體型(AGG)與FEV1和FEV1/FVC明顯相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表7。上述單體型中都包含有前述的單點(diǎn)分析的陽(yáng)性位點(diǎn)。

表6 兩基因與COPD發(fā)病的單體型分析

僅列出了P<0.05的單體型，Pspecific值是指在3個(gè)位點(diǎn)構(gòu)成的單體型中最小的P值；Pglobal值是指3個(gè)位點(diǎn)構(gòu)成的單體型中總體P值；單體型組合中的SNPs的序號(hào)與表2中各基因的SNPs序號(hào)一致；下表同；F_A：在COPD組的單體型頻率，F(xiàn)_U：在對(duì)照組中的單體型頻率

表7 兩基因與基線肺功能的單體型分析

3 討 論

EPHX1是由支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)的具有解毒功能的異物代謝酶。EPHX1基因位于1q42.1染色體，已經(jīng)較為明確的基因多態(tài)性表現(xiàn)在外顯子3(rs1051740)和外顯子4(rs2234922)，外顯子3的基因突變型為T-C替換，組氨酸取代113位的酪氨酸(Try113-His)，酶活性減少50%(慢等位基因型)；外顯子4的突變?yōu)锳-G替換，精氨酸取代139位的組氨酸(His-Arg)，酶活性增強(qiáng)25%(快等位基因型)。Smith等〔3〕首次報(bào)道EPHX1的基因多態(tài)性與肺氣腫的發(fā)病相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)慢等位基因頻率在肺氣腫患者中的發(fā)生率(28%)明顯高于對(duì)照組(6%)。然而，之后其他研究均未發(fā)現(xiàn)外顯子3和4的等位基因頻率在COPD組和對(duì)照組中有明顯差別〔17～19〕。目前對(duì)于中國(guó)北方漢族人的研究亦有不同的結(jié)果，張榮葆等〔8〕的研究表明EPHX1的基因多態(tài)性與中國(guó)COPD的易感性無(wú)相關(guān)性，但肖丹等〔9〕的研究表明EPHX1的基因多態(tài)性與中國(guó)COPD的易感性相關(guān)，并且EPHX1的基因型與吸煙之間有交互作用。但是鑒于這2個(gè)研究的樣本量較少，EPHX1是否為中國(guó)人群中COPD的易感基因尚需更大的樣本來(lái)驗(yàn)證。

對(duì)于上述較為關(guān)注的2個(gè)SNPs位點(diǎn)，本研究未發(fā)現(xiàn)其與COPD易感性及肺功能表型相關(guān)。而另2個(gè)以前鮮有報(bào)道的SNPs位點(diǎn)rs3738040和rs3766934則分別顯示與COPD發(fā)病及肺功能表型顯著相關(guān)。在經(jīng)過(guò)Bonferroni多重檢驗(yàn)后，除rs3738040與FEV1相關(guān)性不顯著外，這2個(gè)位點(diǎn)仍顯示與肺功能表型顯著相關(guān)。Bonferroni多重檢驗(yàn)是目前在多位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析中為降低統(tǒng)計(jì)學(xué)方面的假陽(yáng)性而進(jìn)行多重檢驗(yàn)的常用方法〔16，20〕。Rs3738040位于啟動(dòng)子區(qū)，而rs3766934位于內(nèi)含子1，由本研究數(shù)據(jù)(研究樣本和基因型)所構(gòu)建的包含8個(gè)SNPs位點(diǎn)的EPHX1基因LD圖譜看，兩者處于強(qiáng)連鎖，D′為0.83，上述2個(gè)SNPs位點(diǎn)均位于第1個(gè)強(qiáng)連鎖區(qū)塊內(nèi)(Block 1)。上述2個(gè)位點(diǎn)所在的區(qū)域，位于RNA選擇性轉(zhuǎn)錄剪切區(qū)〔21〕。研究發(fā)現(xiàn)〔21〕，位于此區(qū)域的一剪切突變位點(diǎn)(外顯子1)在肝臟中呈高表達(dá)，而另一變異體也同時(shí)在機(jī)體的其他部位包括肺臟中表達(dá)。每一個(gè)剪切變異體都有自己的5′端啟動(dòng)子區(qū)，提示這個(gè)區(qū)域在調(diào)節(jié)EPHX1 mRNA水平方面存在組織特異性。目前已有研究表明，此區(qū)域與COPD患者的某些數(shù)量性狀密切相關(guān)〔11〕。本研究中的2個(gè)陽(yáng)性SNPs位點(diǎn)具體通過(guò)何種途徑對(duì)COPD及其肺功能表型進(jìn)行影響尚需進(jìn)一步探討。

此外，單體型分析對(duì)識(shí)別某些不能直接觀察到的致病位點(diǎn)有一定的優(yōu)勢(shì)。研究表明，探討基因和疾病相互關(guān)系時(shí)，應(yīng)用單體型信息和用SNPs為基礎(chǔ)的單點(diǎn)分析相比，其可信度可增加15%～50%〔22，23〕。因此，在相關(guān)分析中聯(lián)合應(yīng)用單點(diǎn)分析和單體型分析對(duì)結(jié)果的判斷更有效〔24〕。綜合單點(diǎn)分析和單體型分析的結(jié)果推測(cè)，中國(guó)北方漢族人群中與肺功能表型相關(guān)的位點(diǎn)可能位于Block 1。

GSTP1屬于GSTs同工酶家族，也是一種重要的抗氧化解毒酶。由于在肺臟組織中的表達(dá)較其他GSTs更豐富，因此被認(rèn)為是在肺臟局部對(duì)異生物質(zhì)解毒的主要GSTs同工酶〔25〕。它的外顯子5、6存在多態(tài)性。在第5外顯子(rs1695)發(fā)生的單個(gè)堿基替換(GTC/ATC，G-A)會(huì)導(dǎo)致105位異亮氨酸(Ile)替換為纈氨酸(Val)；第6外顯子發(fā)生(GCG/GTG，C-T)替換，導(dǎo)致114位的氨基酸由丙氨酸(Ala)替換為Val。研究進(jìn)一步證實(shí)GSTP1純合野生型(105 ILe/ ILe)的催化活性顯著高于雜合型(105 Ile/ Val)和純合變異型(105 Val/ Val)。GSTP1的基因型分布在不同種族間差異極大。Ishii等〔5〕在病例-對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)GSTP1 105位Ile純合子的比例在COPD患者較對(duì)照組明顯升高。而Yim 等〔6〕在研究中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性。本研究同樣未發(fā)現(xiàn)rs1695與COPD易感相關(guān)，但發(fā)現(xiàn)另一與COPD發(fā)病及肺功能表型顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)——rs36211088，且在經(jīng)過(guò)Bonferroni多重檢驗(yàn)后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，在HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)及本研究數(shù)據(jù)構(gòu)建的LD圖譜中，此位點(diǎn)與其他SNPs位點(diǎn)的連鎖程度較弱。此外，雖然單體型分析表明包含rs36211088A，rs4147581G，rs1695G的單體型頻率在病例和對(duì)照組中有明顯差別(Pspecific=0.010)，但AGG單體型頻率極低(Fre=0.02)。而且與肺功能表型的相關(guān)性分析中也是同樣的結(jié)果。故此位點(diǎn)在COPD發(fā)病中的作用尚需進(jìn)一步探討。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在中國(guó)北方漢族中，異生物代謝酶EPHX1和GSTP1的基因多態(tài)性可能與肺功能表型相關(guān)。本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果不一致的原因可能有以下幾點(diǎn)：①不同種族的遺傳背景不同，不同人群各SNPs位點(diǎn)間的LD程度和形式不同等。②在不同研究人群內(nèi)部基因與基因，基因與環(huán)境等之間的相互作用都是其影響因素。本研究結(jié)果有望進(jìn)一步深化COPD發(fā)病的分子機(jī)制研究，豐富國(guó)人COPD遺傳易感機(jī)制方面的知識(shí)。本研究尚存在一定缺陷，樣本量不夠大，同時(shí)未能進(jìn)行重復(fù)人群的驗(yàn)證。