王 成，陸雨菲，劉 箐

（1．上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院 生物醫(yī)學光學與視光學研究所，上海 200093；2．上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院 系統(tǒng)生物醫(yī)學研究中心，上海 200093）

引 言

金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等食源性致病菌[1], 對食品安全構成了嚴重的威脅。在美國每年由于食源性致病菌造成的損失高達數(shù)百億美元[2]。我國2016年第二季度食品安全抽檢結果表明[3]，約四分之一的食品存在嚴重的食源性致病菌污染問題。隨著經(jīng)濟全球化的發(fā)展，食源性致病菌的中毒事件呈現(xiàn)出更廣泛的爆發(fā)形勢。因此，建立快速檢測食源性致病菌的新技術已經(jīng)成為控制和維護食品安全的關鍵。

目前對食品微生物的主流檢測方法仍以生化培養(yǎng)分析法為主[4-8]，對致病菌的檢測過程所需平均時間為1～2天。面對生長較為緩慢的致病菌(如分枝桿菌)時，分析過程可能需要幾周時間才能完成。常規(guī)檢測方法通過取樣、培養(yǎng)、分析、對比等手段來獲得參數(shù)結果，存在操作繁瑣、耗時較多等弊端。目前微生物檢測的“金標準”仍是常規(guī)的生化鑒定法[9-12]。免疫學檢測技術已經(jīng)較為成熟，但如何克服靈敏度和特異性之間的矛盾從而實現(xiàn)精準的定量分析，是免疫學檢測法長期需要攻克的問題[13]。利用生物芯片進行檢測鑒定具有實效性，但成本太高，難以普及[14]。為了迎合食品安全檢測的迫切需求，適用于食源性致病菌現(xiàn)場檢測的技術需要具備重現(xiàn)性好、便攜快捷等性能。

光譜中負載著特定的分子信息，近幾十年來一直被用于檢測和識別生物物質。光譜分析技術可脫離實驗室環(huán)境，降低檢測成本，避免環(huán)境污染，實現(xiàn)快速、精確的在線監(jiān)測。在減少微生物培養(yǎng)時間的同時，可提高檢測鑒定效率[15-16]。這種具有非侵入性和非破壞性特點的檢測方法在食源性檢測領域具有良好的前景。

1 光譜技術在食源性致病菌檢測領域的應用

1.1 紅外光譜技術

紅外吸收光譜是一種用于物質分子研究的分子振動光譜[17]，依據(jù)紅外吸收光譜的峰位、峰強和峰形可以識別菌體細胞[18]。2017年，Wang等[19]用同步加速器紅外顯微光譜儀采集了單核增生性李斯特菌等6種常見食源性致病菌的光譜，如圖1所示。研究表明3 000～2 800 cm?1，1 800～1 500 cm?1和 1 200～900 cm?1波長區(qū)域分別代表脂質、蛋白質和多糖，根據(jù)這三個波段內的差異可以對細菌進行鑒別。與傳統(tǒng)的紅外光譜技術相比，此方法只需幾微升的細菌懸浮液就能在幾分鐘內在種和亞種水平對食源性致病菌加以區(qū)分，更加高效便捷。

現(xiàn)有研究表明，將紅外光譜和計量統(tǒng)計學相關方法結合，可以有效識別常見食源性致病菌。此方法需要突破的核心問題是實際應用場合中存在的噪聲和大量干擾因素，在光譜分析與建模過程中要開發(fā)具有高抗擾能力的數(shù)據(jù)處理方法?；旌先芤菏鞘称钒踩l(wèi)生領域常見的物質形態(tài)，其光譜具有復雜的干擾因素，對其在線監(jiān)測有一定的影響，因此還需要進一步的研究探索。

圖1 典型致病菌的紅外光譜[19]Fig. 1 The infrared spectra of typical pathogens[19]

1.2 近紅外光譜技術

近紅外(NIR)光譜承載的信息主要包括分子化學鍵振動的倍頻與組頻信息。當用近紅外光照射樣品時，近紅外光譜中承載著分子轉動和振動的特征信息[20]。在細菌檢測方面，研究者將近紅外光譜技術和數(shù)理統(tǒng)計學分析方法結合，取得了較為滿意的識別結果[21]。2017年，Zhang等[22]建立了一種近紅外免疫層析技術，使用其所建立的近紅外免疫法對副溶血弧菌進行了檢測，在45 min內檢測限達到1.2×102CFU/mL，并與其他菌種無交叉識別。此方法適用于復雜樣品的快速檢測。Xu等[23]將比色度傳感器和近紅外光譜法結合，分別用比色度傳感器和近紅外光譜法獲得了假單胞菌的氣味和光譜信息，從中提取了36種氣味因子和33個光譜特征變量，采集的原始光譜及經(jīng)過標準正態(tài)變量(SNV)處理的光譜分別如圖2和圖3所示?；谥鞒煞址治?PCA)對所提取的數(shù)據(jù)進行融合，同時利用反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡建立識別模型，對不同的假單胞菌進行識別，其中5組假單胞菌的PCA結果如圖4所示，識別正確率達到98.75%。

圖2 原始光譜圖[23]Fig. 2 Averaged raw spectra[23]

圖3 SNV 處理后的光譜圖[23]Fig. 3 Preprocessed spectrum by SNV[23]

圖4 5 組假單胞菌的主成分分析結果[23]Fig. 4 PCA classification results for five groups of Pseudomonas spp.[23]

NIR技術結合自動識別算法可以實現(xiàn)食源性致病菌的快速檢測。目前多數(shù)研究以菌種水平分類為主，關于亞種水平的相關研究還處于起步階段[24]。此外，近紅外光譜本身具有嚴重的多重共線性，在數(shù)據(jù)分析過程中應該建立有效的建模算法來消除多重共線性。

1.3 表面增強拉曼光譜技術

表面增強拉曼光譜(SERS)技術是Fleischmann等[25]在1974年的研究中提出的。此后SERS技術便成為光譜領域里最為重要的研究課題。SERS以金屬納米結構介導信號，可實現(xiàn)高達1014倍的單分子拉曼信號增強，可以在保證靈敏度的同時有效降低檢測限[26]。同時SERS技術具有靈敏度高、選擇性好、獲取信號精準度高等優(yōu)點。2017年，Gao等[27]以金納米顆粒(AuNP)為納米顆粒團作為SERS增強基底對金黃色葡萄球菌進行檢測，檢測限低至1.5 CFU/mL。與現(xiàn)有檢測方法相比，此技術可以用于混合樣本中原位細菌的快速檢測。此方法實用性及靈敏度較高，應用潛力較大。為了進一步提高靈敏度，Pearson等[28]開發(fā)了一種基于3-巰基苯磺酸(3-mbpa)的核酸適配子技術，以李斯特菌作為目標菌種，在3-巰基苯磺酸和銀納米顆粒(AgNP)的相互作用下形成了具有選擇性的SERS。此方法最低檢測限為102 CFU/mL，在降低檢測限的同時保證了較高的準確率，不足之處在于前處理過程較為繁瑣，同時拉曼基底的穩(wěn)定性還有待提高。以上這兩種方法仍停留在實驗室實驗階段，要投入實際應用還需不斷探索。為了提高食源性致病菌檢測準確性，許多研究者對于混合盲樣中檢出某種特定菌進行了研究。Chen等[29]以AuNP為SERS基底，用NIR-SERS技術采集飲用水中的大腸桿菌、單核增生性李斯特菌等幾種常見食源性致病菌的光譜進行檢測，并對兩株李斯特菌的光譜進行比較。兩株李斯特菌的拉曼光譜及特征峰歸一化強度比分別如圖5和圖6所示。在5 min之內檢測到拉曼信號并將兩株金黃色葡萄球菌從其它菌株中分離出來。該方法可選擇性區(qū)分不同的細菌種類，并有潛力用于生物醫(yī)學和食品安全應用的現(xiàn)場診斷領域。為了進一步提高檢測靈敏度，同組成員 Mungroo等[30]以銀納米溶膠作為SERS基底，結合聚類分析和主成分分析兩種方法，建立了一套快速檢測病菌的便攜式系統(tǒng)，結合微流控平臺成功地區(qū)分了大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌等8種不同的致病菌。該方法可以區(qū)分復雜微生物溶液中的特定菌種，同時提供了一個可以快速、實時檢出食源性致病菌的平臺，并且不需要昂貴的管理費用，市場化前景良好。目前應用高靈敏度的方法和平臺對樣本進行定量分析仍然具有很大的挑戰(zhàn)性。在后續(xù)的研究中，SERS技術應該增強復合標簽能力，提高生物相容性[31]，以獲得復雜樣品中靈敏度較高、重現(xiàn)性良好的結果。

圖5 2 株李斯特菌的拉曼光譜[29]Fig. 5 Two species of Listeria[29]

圖6 2株李斯特菌的特征峰歸一化強度比[29]Fig. 6 Normalized intensity ratio of significant peaks from two Listeria spp.[29]

1.4 熒光光譜技術

熒光光譜具有靈敏度和選擇性較高、信號重現(xiàn)性好、測量精度較高的優(yōu)點，多用于定量分析[32]。2017年，Silva等[33]測量了不動桿菌的4種不同基因型的二維熒光光譜，用偏最小二乘法對其進行建模分類，識別準確率高達97.7%。不足之處是需要實驗環(huán)境溫度保持恒溫狀態(tài)，此方法難以適用于現(xiàn)場檢測。白冰等[34]將納米免疫磁珠富集技術和熒光光譜技術相結合，檢測金黃色葡萄球菌和福氏志賀氏菌的混合溶液，各濃度目標菌的熒光強度如圖7所示，細菌菌落數(shù)對數(shù)值與目標菌相對熒光強度的線性關系如圖8所示。結果表明，此方法在2 h內對福氏志賀氏菌的平均捕獲效率高達88.73%。該方法與傳統(tǒng)檢測方法相比更加高效快捷。目前，研究者多將熒光光譜技術和微流控芯片技術相結合，在如何對檢測系統(tǒng)進行優(yōu)化改進，從而實現(xiàn)自動化、高通量的原位識別分選等方面還存在著極大的研究和發(fā)展空間。

圖7 對各濃度目標細菌熒光強度的測定[34]Fig. 7 Determination of fluorescence intensity of different concentration of target bacterial pathogens[34]

1.5 小 結

表1分別通過檢測限、檢測時間、被檢菌種等指標列舉了上述光譜技術在食源性致病菌檢測中的應用。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術、NIR和SERS技術可以快速獲取食源性致病菌的生化指紋。但FTIR技術對水較為敏感，這限制了它在檢測領域的應用。SERS可提供與FTIR互補的微生物指紋信息，并且不受水的影響，因此更加適用于檢測溶液狀態(tài)的樣品?，F(xiàn)有SERS技術雖然已經(jīng)實現(xiàn)單菌水平的檢測，但納米基底的生物相容性是否良好仍然會嚴重影響檢測結果的重現(xiàn)性。熒光光譜技術多與微流控芯片分析方法結合，已經(jīng)突破傳統(tǒng)致病微生物檢測法的部分瓶頸和局限[35]，為了將其推廣并應用于食源性致病菌現(xiàn)場檢測領域，我們還需要繼續(xù)完善優(yōu)化其中的各項實驗，以達到產(chǎn)品化的目的。

圖8 細菌菌落數(shù)的對數(shù)值與目標菌的相對熒光強度值的線性關系[34]Fig. 8 Linear relationship between the change in relative fluorescence intensity and the logarithmic value of target bacterial pathogens[34]

表1 光譜分析用于食源性致病菌檢測Tab. 1 Spectral technique in the detection of foodborne pathogenic bacteria

2 彈性散射光譜技術在食源性致病菌檢測領域的應用

2.1 動態(tài)光散射技術

動態(tài)光散射(DLS)基于實時監(jiān)控，通過統(tǒng)計樣品中各種散射顆粒的散射光總強度隨時間的變化趨勢，從而分析顆粒大小、狀態(tài)等信息。納米金顆粒在特定的波長會產(chǎn)生強烈的光散射信號，鑒于此特性，Huang等[42]將AuNP和DLS技術結合，構建的DLS分析流程如圖9所示。該方法顯示出良好的選擇性和特異性。在0.01%的磷酸鹽懸浮液中，30 min內對李斯特菌的檢測極限低至3.5 CFU/mL，在生菜樣品中檢測限低至22 CFU/g。該方法為混合菌種中檢測目標菌種的相關研究提供了新的分析方法和研究平臺，在復雜的底物中對目標菌種進行準確檢測，可用于快速實時的現(xiàn)場檢測。

圖9 DLS 分析流程圖[36]Fig. 9 Schematic of the proposed DLS assay format[36]

2.2 表面等離子共振光散射技術

表面等離子共振(SPR)技術[43-44]是一種利用反射光譜進行病原菌檢測的常見方法。其檢測原理是通過測量共振角度的變化檢測分子間相互作用。當金屬表面的物質或物質量發(fā)生變化時，折射率發(fā)生變化，表現(xiàn)為共振角的偏移, 共振角會隨金屬薄膜表面通過的液相折射率的改變而改變, 折射率的變化(RIU)又與結合到金屬表面的生物分子質量成正比。SPR能夠檢測到折光率微小的變化。病原菌的直接標記檢測也可以利用此種方法。

1998年 Fratamico等[43]首次使用SPR傳感器檢測大腸桿菌0157：H7以來，SPR傳感器已經(jīng)成為典型的生物分析工具。目前利用SPR技術的生物傳感器可以對單增李斯特菌、沙門氏菌[45]、大腸桿菌O157：H7以及空腸彎曲菌等食源性病原菌進行檢測。2016年，Nguyen等[46]利用便攜式表面等離子共振技術檢測了沙門氏菌，在1 h內檢測限達到107～109CFU/mL。盡管檢測限不夠低，但便攜式SPR傳感器是可以用于食品安全檢測的。未來可以通過提高靈敏度從而降低檢測限。Oh等[47]用金納米顆粒增強便攜式SPR生物傳感器設備對豬肉表面的鼠傷寒沙門氏菌進行了研究，他們對樣品進行實時處理并在注入樣品30～35 min后得到了結果，檢測流程如圖10所示。結果表明，該設備的檢測靈敏度為104CFU/mL。這種生物傳感器只對沙門氏菌有特異檢出效果。一個良好的生物傳感器必須具備從復雜的混合物中檢測出目標分析物的能力, 即使是在有背景微生物的情況下也能顯示出高靈敏度和高選擇性。

圖10 表面等離子共振芯片傳感器檢測豬肉中的鼠傷寒沙門氏菌[41]Fig. 10 Detection of S. typhimurium in pork using the aptamer-based localized surface plasmon resonance sensing chip[41]

2.3 其他彈性散射技術

Jo等[48]搭建了基于傅里葉變換光散射(FTLS)的測量系統(tǒng)，結合統(tǒng)計學方法在單菌水平對李斯特菌、大腸桿菌、乳桿菌、枯草芽胞桿菌實現(xiàn)了無標記識別。利用FTLS技術精確地測定了菌體的二維角散射圖，并提取了具有指紋特性的圖譜。結果表明對盲樣的識別率高達94%。該方法在單菌水平實現(xiàn)了無標記檢測，有效節(jié)約了時間成本，在食源性致病菌快速檢測領域具有廣泛的適用性。Huffman等[49]利用多波長的角散射光譜技術，分析了6種主要食源性致病菌，其中對金黃色葡萄球菌的靈敏度高達94.6%。該系統(tǒng)可以取代需要革蘭氏染色劑的傳統(tǒng)金黃色葡萄球菌檢測手段，為快速檢測金黃色葡萄球菌搭建了一個靈敏度較高的技術平臺，同時為其他致病微生物的識別檢測開拓了全新的鑒定思路。

2.4 小 結

基于彈性光散射的光學檢測方法可以將菌體細胞的空間信息加載在光譜信息中，無需復雜的前處理過程，即可實現(xiàn)在體測量細胞內部結構分布狀態(tài)。通過對散射光譜進行特征提取，可以對不同的菌體細胞進行分析辨別。相對于非彈性散射檢測技術，彈性光散射光譜可以描述不同種類菌體細胞形態(tài)及細胞器的光譜特征。該測量方法具有系統(tǒng)簡單、重復性好、光譜信號精度高等優(yōu)點，更有利于便攜式檢測設備的設計搭建，從而滿足現(xiàn)場檢測的要求。由于此特性，彈性光散射技術在檢測領域的應用逐漸引起研究者們的關注。

3 展 望

通過對食源性致病菌進行識別檢測，可以有效阻止惡性食品安全事件的發(fā)生?，F(xiàn)有的快速檢測技術實現(xiàn)單菌水平的定量檢測仍有一定困難[50]，且大多停留在實驗室階段，距離產(chǎn)品化的實現(xiàn)還需要更多的研究論證。隨著檢測技術的發(fā)展，針對食源性致病菌的檢測方法不斷涌現(xiàn),穩(wěn)定性不足、靈敏度較低等仍是研究者們需要攻克的主要問題。光譜分析方法具有非侵入和無損的特點，近幾年來，光譜技術在食源性致病菌檢測領域大量研究表明，此方法可以有效替代傳統(tǒng)檢測方法，其應用也得到了迅速的發(fā)展。

光學散射是微小顆粒與光作用的主要形式，散射光特性與散射粒子的特性有直接的聯(lián)系?；趶椥怨馍⑸涞臏y量方法具有便捷且精度高等優(yōu)勢，能滿足當前快速、在線檢測的需求。我們在單細胞分析的共焦彈性散射光譜研究的基礎上[51]，應該開展單菌水平快速、實時、無標記自動識別技術研究。通過建立無標記的菌體細胞共焦后向散射光譜數(shù)據(jù)庫[52]，結合微流控分析平臺，實現(xiàn)循環(huán)狀態(tài)下多種混合致病菌的檢測和分選，使其更有潛力應用于臨床或現(xiàn)場檢測。此外，為了將彈性散射光譜法作為一種具有廣泛適用性的技術進行推廣，還應該在以下幾方面進行深入的探索。

(1)進一步評價光譜技術在食源性致病菌檢測領域應用的可靠性。對光譜技術鑒定檢測微生物的靈敏度及準確性進行評價。通過探索可行且規(guī)范的樣品前處理操作標準來提高光譜分析法的準確度。

(2)隨著微流控芯片技術的逐步成熟，光譜技術還將與微流控芯片分析法結合，在提高系統(tǒng)穩(wěn)定性、簡化樣品前處理過程、提高檢測平臺的自動化程度、實現(xiàn)在線實時檢測等方面顯示出強勁的發(fā)展?jié)摿53]。

(3)在處理光譜信號的過程中，對建模算法進行優(yōu)化，從而提高模型分類效率，實現(xiàn)樣本信息的自動采集，建立自動化的檢測系統(tǒng)。