王保永，夏艷麗，肖鴻麗，閆一帆，趙巧飛，張 瑜，陳宏偉

(鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，河南洛陽(yáng) 471000)

miRNA是一類短的(18～25核苷酸)非編碼RNA,可結(jié)合到靶基因并導(dǎo)致目標(biāo)mRNA降解或翻譯抑制使靶蛋白的表達(dá)水平降低[1-2]。miR-138在膽囊癌[3]、食道癌[4]等腫瘤中發(fā)揮抑瘤作用。肝癌細(xì)胞中miR-138被證實(shí)可直接靶向波形蛋白mRNA上或下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D3(CCND3)及波形蛋白[5-6]，提示其在肝癌發(fā)生和發(fā)展中可能起著重要作用，但miR-138如何影響肝癌細(xì)胞的遷移及入侵尚未明確。本試驗(yàn)旨在研究miR-138如何通過(guò)波形蛋白和CCND3對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移及增殖發(fā)揮作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1研究材料 選取22例肝癌組織和癌旁組織作為研究材料，包括11例組織病理學(xué)確診的肝癌組織及11例相應(yīng)的癌旁組織。其中，男7例，女5例，平均年齡57.3歲。標(biāo)本保存于-80 ℃待用。所有患者術(shù)前未進(jìn)行過(guò)放、化療等抗腫瘤治療，并簽署知情同意書(shū)。本研究已經(jīng)通過(guò)了本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審批。肝癌細(xì)胞系HepG2、HHCC、HUH7、BEL-7402及正常肝細(xì)胞系HL-7702均從美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)購(gòu)買。

1.1.2試驗(yàn)試劑及器材 研究中所使用的miR-138 RT-PCR引物委托上海生工生物有限公司進(jìn)行合成。引物序列如下，miR-138：上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAGCTGGTGTTTGAATCA-3′，下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC GGCCTG-3′。靶向miR-138的模擬物和抑制劑：委托廣州銳博生物公司進(jìn)行設(shè)計(jì)并合成。序列如下,miR-138模擬物(mimics)：5′-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3′；miR-138抑制劑(inhibitor):5′-CGGCCUGAUUCACAACACCAGCU-3′。

主要試劑：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自大連寶生物公司；RNeasy Plus Micro Kit購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司；SuperScript?Ⅳ試劑盒、脂質(zhì)體2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自德國(guó)Millipore公司；抗CCND3一抗、抗波形蛋白一抗及goat anti-rabbit 免疫球蛋白G(IgG)-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Dulbecco′s Modified Eagle 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 正常肝細(xì)胞系HL-7702及肝癌細(xì)胞系HepG2、HHCC、HUH7和BEL-7402均采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加10% FBS,100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素，并將細(xì)胞置于含5%CO2,濕度為95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱于37 ℃條件下培養(yǎng)。行轉(zhuǎn)染操作前24 h，將細(xì)胞覆蓋在不含抗生素的500 μL生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，從而使得細(xì)胞在進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作時(shí)達(dá)到30%～50%的融合；按照LipofectamineTM2000的說(shuō)明書(shū)所述步驟進(jìn)行操作。分別將空脂質(zhì)體(作為對(duì)照)、模擬物及抑制劑轉(zhuǎn)染至HepG2肝癌細(xì)胞。

1.2.2RT-PCR 試驗(yàn)應(yīng)用RNeasy Plus Micro Kit試劑盒對(duì)癌旁肝組織、肝癌組織及細(xì)胞的總RNA進(jìn)行提取。應(yīng)用SuperScript?Ⅳ試劑盒將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：65 ℃ 5 min，50 ℃ 10 min，80 ℃ 10 min。1 μL RNA酶，37 ℃ 20 min孵育后,去除RNA。產(chǎn)物用于下一步PCR反應(yīng)。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒行RT-PCR檢測(cè)miR-138的表達(dá)。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 60 s，4 ℃保溫，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法分析各基因miR-138表達(dá)，反應(yīng)設(shè)置3個(gè)無(wú)模板的陰性對(duì)照，計(jì)算循環(huán)閾值(Ct)，并以U6為內(nèi)參計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化Ct值，即ΔCt=CtmiR-138-CtU6。為了方便計(jì)算，miR-138的表達(dá)水平以2-ΔΔCt計(jì)算。

1.2.3Western blot 采用Western blot的方法檢測(cè)波形蛋白 和 CCND3的表達(dá)。離心收集細(xì)胞，在細(xì)胞中加入RIPA buffer細(xì)胞裂解液，反復(fù)離心收集上清液。利用牛血清清蛋白(BCA)試劑盒對(duì)所得上清液中總蛋白水平進(jìn)行測(cè)定。行BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建及樣品蛋白濃度測(cè)定；通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜及抗體孵育后，按照ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)PVDF膜進(jìn)行發(fā)光顯色。

1.2.4細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 向96孔反應(yīng)板中注入細(xì)胞懸浮液(每孔100 μL)。將孔板置入潮濕環(huán)境中(37 ℃,5%CO2)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)?？装逯懈骺滋砑?0 μL CCK-8溶液并孵育1～4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定各樣品的光密度值(OD值，450 nm)。利用EdU試劑盒對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行測(cè)定。種適當(dāng)數(shù)量細(xì)胞，用DMEM完全細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，并用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋EdU溶液(1∶1 000)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)試并行熒光顯微鏡觀察。

1.2.5細(xì)胞創(chuàng)傷愈合試驗(yàn) 將一定密度的細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板并培養(yǎng)24 h直至達(dá)到70%～80%融合度，運(yùn)用滅菌的200 μL移液槍槍頭在培養(yǎng)基表面劃痕。沖洗脫落細(xì)胞，孔板添加新鮮培養(yǎng)基并培養(yǎng)細(xì)胞48 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2次，固定后顯微鏡觀察不同視野的單層細(xì)胞，拍照后劃痕距離應(yīng)用ImagJ軟件進(jìn)行測(cè)量并計(jì)算均值及方差。

1.2.6細(xì)胞遷移試驗(yàn) 將傳代2～3次且80%融合的細(xì)胞在適宜的無(wú)血漿培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h，使用無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞2次。進(jìn)行離心操作并獲得細(xì)胞沉淀(1 500 r/min,10 min)。重懸細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使得細(xì)胞數(shù)量為(0.5～1.0)×106/mL。用鉗子夾取Transwell小室，往Transwell小室中添加300 mL上述細(xì)胞懸浮液，下室中則加入500 mL不含血漿的培養(yǎng)基，37 ℃條件下在5%CO2培養(yǎng)室培養(yǎng)24 h。用移液槍從上室中剩余的細(xì)胞懸浮液吸出，將Transwell小室移入含400 μL 細(xì)胞染色液的潔凈孔板內(nèi)，室溫培養(yǎng)20 min，多次漂洗Transwell小室，用1根棉簽拭子將Transwell小室里側(cè)的非滲移性細(xì)胞層輕輕擦除。將染色的Transwell小室轉(zhuǎn)入內(nèi)含200 μL 提取緩沖液的清潔孔板內(nèi)，輕輕搖晃傾斜Transwell小室，重復(fù)10次，盡量將染色的細(xì)胞從其底部取出，并將Transwell小室從孔板內(nèi)移出。100 μL 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入適于比色測(cè)定的96孔微量滴定板中，在顯微鏡的明亮視野中對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1miR-138 mRNA在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)肝癌組織及癌旁組織中miR-138表達(dá)顯示，與癌旁組織相比，miR-138的mRNA在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

2.2miR-138 mRNA在正常肝細(xì)胞系及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá) 與正常肝細(xì)胞系HL-7702相比，miR-138的mRNA表達(dá)水平在肝癌細(xì)胞系HepG2、HUH7、HHCC及 BEL-7402中均明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 正常肝細(xì)胞系及肝癌細(xì)胞系中的miR-138 mRNA表達(dá)水平

圖3 miR-138 mimics和inhibitor干擾后miR-138的表達(dá)水平

圖4 CCK-8法檢測(cè)干擾miR-138后的肝癌細(xì)胞活力

2.3miR-138 mimics及inhibitor對(duì)肝癌細(xì)胞系miR-138的表達(dá)的影響 與對(duì)照相比，當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-138 inhibitor，miR-138的表達(dá)顯著降低(P<0.01)；轉(zhuǎn)染miR-138 mimics時(shí)miR-138的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

A：各組細(xì)胞創(chuàng)傷愈合能力比較；B:各組細(xì)胞遷移能力比較

圖6 干擾miR-138的肝癌細(xì)胞遷的柱狀圖

A：Western blot蛋白圖；B:各組波形蛋白和CCND3的蛋白表達(dá)量柱狀圖

圖7 Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.4CCK-8法檢測(cè)干擾miR-138的肝癌細(xì)胞活力 當(dāng)類似物轉(zhuǎn)染72 h后，相較于對(duì)照，HepG2細(xì)胞的增殖能力降低(P<0.01)；當(dāng)miR-138 inhibitor轉(zhuǎn)染72 h后，HepG2細(xì)胞的增殖能力升高(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

2.5干擾miR-138對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響 當(dāng)miR-138 mimics 轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，相較于對(duì)照，HepG2細(xì)胞的創(chuàng)傷愈合能力較弱，遷移能力明顯降低(P<0.01)；當(dāng)miR-138 inhibitor 轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，相較于對(duì)照，HepG2細(xì)胞的創(chuàng)傷愈合能力增強(qiáng)，遷移能力明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)圖5、6。

2.6干擾miR-138的miR-138相關(guān)靶蛋白的表達(dá)水平比較 Western blot結(jié)果表明，當(dāng)miR-138 mimics轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，相較于對(duì)照，波形蛋白和CCND3的表達(dá)水平降低(P<0.01)；當(dāng)miR-138 inhibitor 轉(zhuǎn)染時(shí)，波形蛋白和 CCND3的表達(dá)水平升高(P<0.01)，見(jiàn)圖7。

3 討 論

miRNA是具有內(nèi)源性、進(jìn)化保守性，天然大量存在且相對(duì)穩(wěn)定的短鏈(約22個(gè)核苷酸)非編碼RNA分子，在多數(shù)生物學(xué)及病理學(xué)過(guò)程中的后轉(zhuǎn)錄階段發(fā)揮了基因調(diào)控的作用[7]。研究表明，大約30%的蛋白質(zhì)的編碼基因受miRNA的調(diào)控，通過(guò)堿基互補(bǔ)原則結(jié)合到目的mRNA上或通過(guò)結(jié)合到5′端非翻譯區(qū)(3′UTR)的非互補(bǔ)位點(diǎn)上并進(jìn)行進(jìn)一步的調(diào)控，從而在翻譯水平上控制基因的表達(dá)[7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超過(guò)45 000個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)存在于人類的3′UTR，并且超過(guò)60%的人類蛋白質(zhì)編碼基因可能受多個(gè)miRNA調(diào)控[8]。miRNA在細(xì)胞核中被RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉(zhuǎn)錄成為長(zhǎng)鏈的、加帽的聚腺苷酸前體，被稱之為初級(jí)微小RNA(pri-miRNA)。核輸出受體輸出蛋白5/Ran GTP將miRNA前體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中[9],然后被RNase Ⅲ內(nèi)切酶Dicer沿著轉(zhuǎn)錄活性相應(yīng)的RNA結(jié)合蛋白(TRBP)進(jìn)行進(jìn)一步加工，成為22個(gè)核苷酸雙鏈RNA結(jié)構(gòu)[9]。這個(gè)miRNA復(fù)合體被解離為成熟的單鏈形式，結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)上，該復(fù)合體可引導(dǎo)與目的mRNA的互補(bǔ)3′UTR端結(jié)合而發(fā)揮作用。

miR-138作為miRNA前體家族之一，可在多種癌癥中起抑瘤作用，比如喉癌[10]、口腔細(xì)胞癌[11]、結(jié)腸癌[12]、非小細(xì)胞肺癌[13]等。研究表明，在肝癌中miR-138表達(dá)下調(diào)并作用于CCND3，可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[5]，但其詳細(xì)的生物學(xué)機(jī)制尚未被完全闡明，miR-138影響肝細(xì)胞肝癌增殖、遷移和入侵機(jī)制仍需要繼續(xù)探索。本試驗(yàn)結(jié)果提示，與癌旁組織及正常肝細(xì)胞系相比，miR-138表達(dá)在肝癌中和肝癌細(xì)胞系中明顯降低。當(dāng)miR-138 mimics轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，HepG2細(xì)胞的活力降低，創(chuàng)傷愈合能力較弱，遷移能力明顯降低，經(jīng)Western blot檢測(cè)，波形蛋白和CCND3的表達(dá)水平降低。轉(zhuǎn)染miR-138 inhibitor后，HepG2細(xì)胞的增殖升高，肝癌細(xì)胞的創(chuàng)傷愈合能力和遷移能力提升，與此同時(shí)，波形蛋白和CCND3的表達(dá)水平升高。本試驗(yàn)證實(shí)了通過(guò)調(diào)控miR-138在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)可以調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、遷移能力及創(chuàng)傷愈合能力，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)miR-138介導(dǎo)的信號(hào)通路，即miR-138通過(guò)調(diào)節(jié)其相關(guān)靶蛋白波形蛋白和CCND3的表達(dá)來(lái)達(dá)到調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖及遷移能力的目的。

波形蛋白是細(xì)胞骨架的主要組成成分，甚至被視為癌變過(guò)程中進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的標(biāo)記。在波形蛋白mRNA序列中可鑒定出3段miR-138的靶向序列。有研究表明，應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)證實(shí)了miR-138可直接靶向波形蛋白mRNA上[6]。細(xì)胞周期受細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDK)家族和其活性分子(細(xì)胞周期素)的調(diào)控。細(xì)胞從G1到S期的相變最初受細(xì)胞周期素D家族成員(CCND1,CCND2和CCND3)與CDK4/CDK6復(fù)合體和細(xì)胞周期素E家族成員(CCNE1和CCNE2)與CDK2復(fù)合體的調(diào)控。已有兩項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌和HCC中miR-138可分別靶向CCND1及CCND3[5,14]，且發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌和肝癌中miR-138的表達(dá)頻繁下調(diào)，CCND1和CCND3的表達(dá)與miR-138的表達(dá)成反比，并在進(jìn)一步的試驗(yàn)中證實(shí)了miR-138可直接特異靶向結(jié)合CCND3 mRNA[5]，以上研究均提示波形蛋白和CCND3在腫瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要的作用。本試驗(yàn)證實(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)miR-138的表達(dá)，可調(diào)節(jié)波形蛋白和CCND3的表達(dá)，而波形蛋白與CCND3在細(xì)胞增殖活性發(fā)揮重要的作用，推測(cè)miR-138通過(guò)波形蛋白及CCND3進(jìn)一步調(diào)節(jié)肝癌的進(jìn)展。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了在調(diào)節(jié)miR-138表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞遷移能力發(fā)生了改變，該結(jié)果與推測(cè)一致，提示miR-138通過(guò)其靶基因波形蛋白和CCND3，可調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞的增殖活力及遷移能力。也有類似的研究表明DBH-AS1經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)黏著斑激酶(FAK)/Src/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)途徑靶向miR-138促進(jìn)肝癌的發(fā)生[15]。miR-138同時(shí)也可在學(xué)習(xí)記憶、心肌保護(hù)及骨生長(zhǎng)等機(jī)制中發(fā)揮重要的作用[16-18]。

綜上所述，本研究果證實(shí)了miR-138是通過(guò)何種靶基因來(lái)達(dá)到對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、入侵的影響，結(jié)果提示miR-138可能是一個(gè)多功能的調(diào)節(jié)子，在HCC發(fā)展中起主要作用。因此，miR-138可能成為治療肝癌的靶基因位點(diǎn)，可抑制肝癌的侵襲。