NDIKUBWIMANA Jean de Dieu，邵侃凱，高曉冬，中西秀樹

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

基因組測序表明，在真核生物中，囊泡融合機制是高度保守的，SNARE蛋白是膜融合蛋白中的重要成員。SNARE蛋白是保守性很強的蛋白家族，經(jīng)常被分為 Q-SNARE蛋白和 R-SNARE蛋白[1]。SNARE蛋白位于特定的膜上，只有當Q-SNARE蛋白 R-SNARE蛋白結(jié)合時，泡膜才能融合[1-2]。SNARE蛋白最初是從神經(jīng)元細胞中分離得到，在突觸囊泡融合中，syntaxin-1和 SNAP-25扮演 QSNARE角色，synaptobrevin則扮演著R-SNARE角色[1-2]。當囊泡膜上的synaptobrevin與syntaxin-1和SNAP-25結(jié)合在一起時，突觸囊泡中的神經(jīng)遞質(zhì)就會釋放出來，傳遞給突觸末段。和突觸囊泡融合SNARE蛋白同源物類似，在釀酒酵母細胞中，QSNARE蛋白Sso1/2和Sec9與R-SNARE蛋白Snc1/2結(jié)合在一起，形成一個平行的四螺旋復合體從而導致酵母細胞膜融合的進行[2-3]。

肉毒神經(jīng)毒素（BotuIinum Neurotoxin，BoNT）是由厭氧梭狀肉毒芽胞桿菌屬生長過程中分泌的多分子復合物外毒素[4]，肉毒神經(jīng)毒素根據(jù)α-血清中和能力分為A-G7種亞型[5]，絕大部分脊椎動物只要攝入微量即可引起肉毒中毒[6]。肉毒神經(jīng)毒素是目前已知毒性最強的神經(jīng)毒素，被美國疾病控制預防中心（CDC）列為A級生物恐怖劑[7]。肉毒神經(jīng)毒素是AB結(jié)構(gòu)的神經(jīng)毒素，由輕鏈（LC，～50 kDa）和重鏈（HC，～100 kDa）通過二硫鍵結(jié)合在一起組成[8]。輕鏈由一個鋅離子依賴的金屬蛋白酶區(qū)域組成，它可以降解 SNARE蛋白；肉毒神經(jīng)毒素類型A，C，E可以降解 SNAP25，類型 B，D，F(xiàn)，G 降解 VAMP-2，另外類型C還可以降解Syntaxin 1a[9-13]。重鏈由兩個區(qū)域組成：一個 N 端轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域（HCT，～50 kDa）和一個 C 端受體結(jié)合區(qū)域（HCR，～50 kDa）[14]。 HCR 進一步分為HCRN和HCRC兩個更小的區(qū)域。HCRN沒有功能活性，但可能參與調(diào)整HCT最優(yōu)的幫助輕鏈進入宿主細胞，而HCRC介導肉毒神經(jīng)毒素結(jié)合到宿主受體[15-16]。Lacy和Stevens解決了肉毒神經(jīng)毒素A的晶體結(jié)構(gòu)[17]。

BoNT不僅僅是一種神經(jīng)毒素，它還可以作為一種治療藥物。早在1954年，Brooks發(fā)現(xiàn)在極度活躍的肌肉注射少量的BoNT/A會破壞運動神經(jīng)末梢乙酰膽堿的釋放，從而引起短暫的肌肉松弛[18]。這一發(fā)現(xiàn)導致了第1次使用BoNT/A作為治療藥物替代傳統(tǒng)手術治療人類斜視[19]。這些開創(chuàng)性的研究后，治療用BoNT/A擴展到各種各樣由于功能失調(diào)的膽堿能終端引起的神經(jīng)障礙，例如痙攣性斜頸、眼瞼痙攣、面部癱瘓、肌張力障礙和痙攣狀態(tài)[20-21]。BoNT/A還用于美容治療和頭痛治療[22]。

雖然目前有不少關于BoNT/A的研究，但關于BoNT/A抗性藥物及其作為藥物用于醫(yī)用治療并不是十分成熟，而且沒有關于酵母肉毒中毒的研究。本研究在釀酒酵母細胞中表達了BoNT/A輕鏈，在釀酒酵母中來研究BoNT/A輕鏈的功能及其能否降解Sec9蛋白。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

釀酒酵母出發(fā)菌株Saccharomyces cerevisiaeYPH499，BoNT/A 表達用質(zhì)粒 pRS426-GAL1pr，SEC9表達用質(zhì)粒pRS414-TEFpr及引物相關信息見表1。SEC9基因由HXS 33和HXS 34引物PCR獲得，△Nsec9基因由HXO 573和HXS 34引物PCR獲得，BoNT/A基因由HXO 72和HXO 73引物PCR獲得，BoNT/AE224Q由 HXS 76和 HXS 77引物PCR獲得。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、DNA T4連接酶及Ligation Mix連接酶購于 TaKaRa公司 （大連）；KOD-Plus Neo DNA聚合酶購于東洋紡公司（上海）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒及脫脂奶粉購于上海生工；ClarityTM Western ECL Substrate顯色劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于碧云天生物技術研究所；Mouse anti-HA一抗、Goat anti-mouse IGg-HRP二抗購于北京全式金生物技術有限公司，v5抗體購于近岸蛋白質(zhì)科技有限公司 （上海），PVDF膜購于美國伯樂公司。無水甲醇、無水乙醇及異丙醇等其他試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

壓力蒸汽滅菌器（立式）購于上海申安器械廠；電泳儀購于北京六一儀器廠；pH計、電子天平購于梅特勒-托利多儀器公司（上海）；無菌操作臺、恒溫培養(yǎng)箱購于上海三發(fā)科學儀器公司；恒溫搖瓶柜購于江蘇太倉強樂設備廠；PCR儀、移液槍購于德國Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)購于美國 Bio-Rad公司；半干電轉(zhuǎn)儀、SDS-PAGE凝膠電泳儀購于美國伯樂公司；紫外分光光度計、ImageQuantTMLAS 400 mini購置于美國GE公司；熒光倒置顯微鏡購自日本尼康公司。

表1 本研究所用的菌株、質(zhì)粒和引物Table 1 Lists of strains，plasmids and primers used in this study

1.4 培養(yǎng)基及其他溶液配制

1）YPAD 培養(yǎng)基：酵母抽提物（Yeast Extract）20 g/L，蛋白胨（Peptone）10 g/L，腺嘌呤（Adeline）30 mg/L，瓊脂粉（Agar）20 g/L（固體培養(yǎng)基），葡萄糖20 g/L。 2）LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨（Tryptone）10 g/L，酵母抽提物 5 g/L，氯化鈉（NaCl）10 g/L，瓊脂粉（Agar）20 g/L （固體培養(yǎng)基）；3）YNB 選擇培養(yǎng)基：YNB（Yeast Nitrogen Base without Amino Acids）6.7 g/L，缺陷型粉末2 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L（固體培養(yǎng)基）。SG培養(yǎng)基是用半乳糖代替葡萄糖。4）8 mol/L 尿素：480.48 g 尿素，8.766 g NaCl，25 mmol/L（pH 8.0），加去離子水定容至 1 L。 5）TBST溶液：5 mol/L NaCl 30 ml，1 mol/L Tris·HCl（pH 8.0）10 mL，Tween20 500 uL，加去離子水定容至 1 L。6）5%脫脂牛奶：稱取5g脫脂奶粉，用TBST定容至100mL。7）轉(zhuǎn)膜緩沖溶液：稱取甘氨酸 14.4 g，Tris·HCl 3.03g，量取無水甲醇200 mL，加去離子水定容至1 L。

1.5 實驗方法

1.5.1 細胞生長分析將質(zhì)粒pRS426-GALpr，pRS426-GALpr-BoNT/A轉(zhuǎn)化至YPH499細胞中，在SD尿嘧啶缺陷平板上篩選陽性克隆。將陽性轉(zhuǎn)化子在以葡萄糖為碳源的尿嘧啶缺陷培養(yǎng)平板劃線培養(yǎng)48 h，分別用牙簽挑取不同的轉(zhuǎn)化子在以葡萄糖和半乳糖為碳源的尿嘧啶缺陷平板上劃線，在30℃培養(yǎng)3 d，觀察細胞的生長情況。

1.5.2 蛋白質(zhì)提取將不同細胞接種在5 mL以葡萄糖為碳源的SD尿嘧啶培養(yǎng)基中于 30℃培養(yǎng)至OD660=1.0，收集細胞轉(zhuǎn)移至25 mL以葡萄糖為碳源的SD尿嘧啶培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)至OD660=1.0，收集細胞轉(zhuǎn)移至30 mL以半乳糖為碳源的SD尿嘧啶培養(yǎng)基中，起始OD660=0.2，30℃培養(yǎng)至OD660=0.8～1.0。不同轉(zhuǎn)化子收集相同數(shù)量的細胞，用去離子水洗細胞1次，加8 mol/L尿素緩沖溶液和蛋白酶抑制劑PMSF，加玻璃珠震蕩破碎細胞，15 000 g，離心10 min取上清即為所提取蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。

1.5.3 蛋白質(zhì)免疫印跡

1）電泳：取100 μg蛋白樣品上樣跑電泳，濃縮膠電壓 80 V，30 min，分離膠電壓 120 V，60 min。 2）轉(zhuǎn)膜：采用半干式轉(zhuǎn)膜方式，電壓25 V，電流1.0 A，時間30 min。3）封閉：5% 的脫脂奶粉封閉 1 h。4）孵育抗體：一抗 1∶5 000，室溫 1 h；二抗 1∶5 000 室溫 1 h。5）顯色：ECL顯色液A和B混勻，涂于膜上，用ImageQuant LAS4000mini顯色。

2 結(jié)果與討論

2.1 BoNT/A抑制釀酒酵母YPH499生長

在人體內(nèi)，BoNT/A作用于神經(jīng)元細胞內(nèi)腔，特異性降解突觸體相關蛋白SNAP25抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放從而導致相關疾病，而酵母細胞中存在SNAP25的同源蛋白Sec9。盡管酵母是真核生物，是研究真核生物的模式生物，但是酵母細胞和哺乳動物細胞存在很大的差異，不知能否在酵母中檢測到BoNT/A的表達？在釀酒酵母YPH499細胞中表達BoNT/A是否會抑制酵母細胞的生長？如圖1所示，在釀酒酵母YPH499細胞中半乳糖誘導培養(yǎng)8 h之后可以檢測到表達的BoNT/A，表達BoNT/A會抑制酵母細胞的生長，這種抑制作用可能是因為BoNT/A過表達在酵母細胞中累積對細胞有毒害作用；也可能是因為過表達BoNT/A降解酵母細胞中膜融合所需要的SNARE蛋白或其他生長必需蛋白。

圖1 BoNT/A抑制釀酒酵母YPH499生長Fig.1 BoNT/A inhibits the growth of yeast

2.2 BoNT/A活性突變體不抑制釀酒酵母YPH499的生長

為了研究在酵母細胞中BoNT/A的活性位點Glu224突變?yōu)镚ln后，突變的BoNT/A表達水平穩(wěn)定性有無影響，對酵母的生長有無影響。如圖2所示，當活性位點突變后，突變體BoNT/A表達水平穩(wěn)定性幾乎沒有變化，并且不抑制釀酒酵母的生長。與本研究結(jié)果類似，Kukreja等研究發(fā)現(xiàn)，BoNT/A的催化活性區(qū)域HEXXH的Glu224突變成Gln后，BoNT/A的催化活性完全失去[23]，這都說明BoNT/A對釀酒酵母的生長抑制作用是通過其水解酶催化活性來實現(xiàn)的。

圖2 BoNT/A活性突變體不抑制釀酒酵母YPH499生長Fig.2 BoNT/A mutant does not inhibit the growth of yeast

2.3 在sec9△中過表達Sec9可以回補酵母的生長

圖3 在sec9△中過表達Sec9可以回補酵母的生長Fig.3 Overexpression of Sec9 in sec9△could rescue the yeast growth

由于SEC9是酵母生長必須基因，在YPH499中敲除SEC9基因的酵母不能生長，因此我們在酵母中先導入一個pRS316-SEC9質(zhì)粒在敲除SEC9基因。如圖 3所示，sec9△（pRS316-SEC9）中導入pRS414TEF-SEC9質(zhì)粒，5-FOA移除pRS316-SEC9質(zhì)粒后 sec9△（pRS414TEF-SEC9）仍可以生長，這說明pRS414TEF-SEC9質(zhì)?？梢栽诮湍钢斜磉_并能回補sec9△菌株的生長。

2.4 在酵母中過表達Sec9可以解除BoNT/A對生長的抑制

從圖2可知，BoNT/A對酵母細胞的生長抑制作用是基于其水解酶蛋白活性。在動物細胞中SNAP25是BoNT/A的降解底物，而在酵母中只有SNAP25的同源基因SEC9，因此，為了探究Sec9蛋白是否會被BoNT/A降解，本文在酵母中過表達Sec9蛋白，觀察是否能回補被BoNT/A抑制的酵母的生長。如圖4所示，過表達Sec9可以回補被BoNT/A抑制的酵母的生長。

圖4 過表達Sec9可以回補BoNT/A對釀酒酵母YPH499的抑制Fig.4 Overexpression of Sec9 could rescue the inhibition of BoNT/A to YPH499

3 結(jié)語

本研究在釀酒酵母細胞中表達了BoNT/A，研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母細胞中BoNT/A通過其水解酶活性抑制酵母細胞的生長，當活性位點被突變，失去水解酶活性的BoNT/A不會抑制酵母細胞的生長?？梢岳媒湍讣毎芯緽oNT/A的功能，同時還可以在酵母細胞中進行BoNT/A抗性藥物的篩選。同時研究還發(fā)現(xiàn)，在表達BoNT/A的釀酒酵母細胞中過表達Sec9蛋白可以解除BoNT/A對酵母細胞的生長抑制作用。可以推測Sec蛋白可能是BoNT/A在酵母細胞中的識別底物，BoNT/A是通過降解Sec9蛋白從而抑制酵母的生長。本研究為酵母中肉毒神經(jīng)毒素的研究提供了一定的理論依據(jù)，可以通過在酵母中表達肉毒神經(jīng)毒素，可以對其功能進行進一步研究，可以在酵母中建立肉毒神經(jīng)毒素篩選系統(tǒng)，還可以探索在酵母中是否存在肉毒神經(jīng)毒素新的降解底物。