陳修來(lái) ，王元彩 ，董曉翔 ，羅秋玲 ，劉 佳 ，劉立明 *

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

L-蘋(píng)果酸作為生物體TCA循環(huán)的重要中間體，在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[1]。早期關(guān)于L-蘋(píng)果酸的研究主要集中于高產(chǎn)菌株的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化[1-2]。通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，如：轉(zhuǎn)速、溶氧、氮源濃度、金屬離子及CaCO3添加量等，使得黃曲霉（Aspergillus flavus）在 190 h時(shí)能夠積累113 g/L的L-蘋(píng)果酸，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.59 g/L/h[1]。由于高產(chǎn)L-蘋(píng)果酸的野生型菌株為霉菌[3]，具有發(fā)酵周期長(zhǎng)、條件難以控制、產(chǎn)生黃曲霉毒素等缺點(diǎn)，使其不能被廣泛的應(yīng)用[4]。因此，近年來(lái)的研究主要集中于代謝工程策略改造常見(jiàn)工業(yè)微生物生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸，如：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[5]、光滑球擬酵母 （Torulopsis glabrata）[6]和大腸桿菌（Escherichia coli）[7-8]等。 由于S.cerevisiae較其他微生物，具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）良好的食品安全性，S.cerevisiae已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域；（2）低pH耐受性，有利于高效積累有機(jī)酸、降低下游提取純化成本；（3）高葡萄糖耐受性，為實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。因此，S.cerevisiae被認(rèn)為是二羧酸生產(chǎn)的潛在高效細(xì)胞工廠[9]。

目前，S.cerevisiae生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸的代謝策略主要有：1）L-蘋(píng)果酸積累路徑的構(gòu)建：以丙酮酸為起點(diǎn)在丙酮酸羧化酶 （PYC）及蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）的作用下積累L-蘋(píng)果酸，即胞質(zhì)還原路徑，因該路徑簡(jiǎn)單且理論得率高，而被廣泛應(yīng)用于二羧酸的生產(chǎn)[7-10]。通過(guò)在丙酮酸高產(chǎn)菌株S.cerevisiaeTAM中過(guò)量表達(dá)基因PYC2和MDH△SKL構(gòu)建L-蘋(píng)果酸積累的胞質(zhì)還原路徑，使得L-蘋(píng)果酸產(chǎn)量提高了3倍[11]；2）轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的強(qiáng)化：研究表明L-蘋(píng)果酸的外轉(zhuǎn)運(yùn)是限制L-蘋(píng)果酸積累的關(guān)鍵性因素[6，12]。在構(gòu)建完成L-蘋(píng)果酸路徑的基礎(chǔ)上，過(guò)量表達(dá)源于栗酒裂殖酵母 （Schizosaccharomyces pombe）的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使得L-蘋(píng)果酸產(chǎn)量提升到了31.5 g/L[5]；3）啟動(dòng)子表達(dá)水平的改造：Pines等[13]利用不同表達(dá)強(qiáng)度的啟動(dòng)子，對(duì)基因MDH2進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，有效的提高了MDH的酶活，最終使得L-蘋(píng)果酸產(chǎn)量達(dá)到11.8 g/L。

本研究以高產(chǎn)丙酮酸的S.cerevisiaetTAM為出發(fā)菌株，利用分子生物學(xué)手段將高產(chǎn)L-蘋(píng)果酸A.flavus代謝路徑表達(dá)于S.cerevisiae中，構(gòu)建Afpyc單表達(dá)，Afpyc、Afmdh雙基因共表達(dá)和Afpyc、Afmdh、Afmae三基因共表達(dá)的工程菌株，通過(guò)分析基因表達(dá)對(duì)碳流分布的影響，探討A.flavus胞質(zhì)還原路徑對(duì)S.cerevisiae積累L-蘋(píng)果酸的影響，為利用代謝工程策略生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒S.cerevisiaeTAM由荷蘭代爾夫特理工大學(xué)Jack T.Pronk教授贈(zèng)送。pY26和pY14購(gòu)自Turbo生物工程有限公司。pMD19-T-simple購(gòu)自TaKaRa（大連）生物工程有限公司。表1為本研究所用的菌株和質(zhì)粒。

1.1.2 主要儀器和試劑紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司，型號(hào)UV2450）；SBA生物傳感儀（山東科學(xué)院生物研究所）；高效液相色譜儀（美國(guó)賽默爾飛，型號(hào)Ultimate 3000）。丙酮酸和L-蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自sigma公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 引物本研究所用引物如表2所示，引物GMC-SacI-S、GMC-NotI-A為擴(kuò)增GPD啟動(dòng)子、多 克 隆 位 點(diǎn) 、CYC1 引 物 ；18SrDNA-BglII-S、18SrDNA-SphI-A為擴(kuò)增18S rDNA引物；rDNAtrp-SacINotI-S、rDNAtrp-NcoI-A 為擴(kuò)增Trp引物。Afpyc-BamH I-S和Afpyc-PstI-A用于擴(kuò)增基因Afpyc；Afmdh-NotI-S和Afmdh-BglII-A用于擴(kuò)增基因Afmdh；Afmae-EcoR I-S和Afmae-XhoI-A用于擴(kuò)增基因Afmae。

1.1.4 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（g/L）：氯化鈉 10，酵母膏5，蛋白胨 10。YNB培養(yǎng)基 （g/L）：葡萄糖20，YNB 6.7，根據(jù)需要添加20 mg/L的氨基酸。種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，YNB 6.7，碳酸鈣 5。發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L）： 葡萄糖 80，K2SO46.6，KH2PO43，MgSO4·7H2O 0.5，尿素終濃度1，生物素終濃度為10-3，CaCl2·2H2O終濃度為0.735，碳酸鈣 25（接種時(shí)添加5 g/L，發(fā)酵48 h時(shí)添加20 g/L），微量金屬離子液、維生素液均為1 mL/L。微量金屬離子液（mg/L）：EDTA 15，ZnSO4·7H2O 4.5，CoCl2·6H2O 0.3，MnCl2·4H2O 1，CuSO4·5H2O 0.3，CaCl2·2H2O 4.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 3，NaMoO4·2H2O 0.4，H3BO31，KI 0.1。 維生素液（mg/L）：生物素 0.05，泛酸鈣 1，煙酸 1，肌醇 25，鹽酸硫胺素1，鹽酸吡哆醇1，對(duì)氨基苯甲酸0.2。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2 分子生物學(xué)操作

1.2.1 RNA的提取及18S rDNA整合表達(dá)框的構(gòu)建利用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒 （上海生工生物），提取總A.flavus的 RNA。按照PrimerScript RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒（TaKaRa），將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，利用引物Afpyc-BamH I-S和Afpyc-PstIA進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得Afpyc基因?；诖?，設(shè)計(jì)Afpyc基因18S rDNA整合表達(dá)框的構(gòu)建流程 （圖1）：（1） 利用引物 GMC-SacI-S、GMC-NotI-A 為擴(kuò)增GPD啟動(dòng)子的表達(dá)元件，并將其連接于pMD19-T-simple載體，獲得pMD19-GMC；（2）利用引物18SrDNA-BglII-S與 18SrDNA-SphI-A、rDNAtrp-SacINotI-S與rDNAtrp-NcoI-A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得18SrDNA基因片段、Trp標(biāo)記基因，并將其連接至pMD19-T-simple載體，獲得pMD19-18S-TRP；（3）將Afpyc基因插入到 pMD19-GMC的GPD啟動(dòng)子的表達(dá)元件中，獲得pMD19-GMCAfpyc；（4） 將 pMD19-18S-TRP 的 18S-TRP 片段，通過(guò)酶切與連接的方法，連接到pMD19-GMCAfpyc，獲得Afpyc基因的融合表達(dá)載體pMD19-GMC-Afpyc-18S-TRP。

圖1 基因Afpyc的18S rDNA整合表達(dá)框構(gòu)建Fig.1 Construction procedure of gene Afpyc intergration plasmid pMD19-GMC-Afpyc-18S-TRP

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建以A.flavusATCC13697的 cDNA為模板，擴(kuò)增關(guān)鍵基因Afpyc、Afmdh、Afmae。利用限制性酶BamH I&PstI、NotI&BglII雙酶切后，借助T4連接酶分別連接至pY14、pY26， 獲得重組質(zhì)粒 pY14/Afpyc、pY26/TEFAfmdh。在此基礎(chǔ)上，利用限制性酶EcoR I&XhoI雙酶切后，借助T4連接酶連接至pY26/TEFAfmdh，獲得重組質(zhì)粒pY26/TEF-Afmdh-GPDAfmae。

1.3 蘋(píng)果酸發(fā)酵條件及參數(shù)測(cè)定

1.3.1 培養(yǎng)條件將平板菌落接種于種子培養(yǎng)基，30℃，200 r/min培養(yǎng) 48 h，4 000 r/min離心 5 min收集菌體。將菌體以發(fā)酵培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整發(fā)酵起始OD600為1.0，30℃，200 r/min培養(yǎng)96 h。 發(fā)酵起始時(shí)，添加5 g/L的CaCO3；當(dāng)發(fā)酵48 h時(shí)，補(bǔ)充20 g/L 的 CaCO3。

1.3.2 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定葡萄糖的測(cè)定：利用SBA-40E生物傳感分析儀測(cè)定，發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)?shù)南♂尯?，?5 μL直接進(jìn)樣到生物傳感器中，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度、儀器讀書(shū)及發(fā)酵液稀釋倍數(shù)計(jì)算發(fā)酵液中的葡萄糖含量。

菌體干重測(cè)定：將發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)后，以相應(yīng)的培養(yǎng)基作為對(duì)照，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光值，并將該吸光值按照細(xì)胞干重 （Dry Cell Weight，DCW）與菌體吸光值的線性曲線（1 OD600=0.23 g/L DCW），計(jì)算菌體干重。

有機(jī)酸測(cè)定：采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定，色譜柱為 Atlantis?C18（5 μm 4.6×250 mm），流動(dòng)相為 0.1 mol/L KH2PO4，pH 2.8；流速為 0.6 mL/min；柱溫為20℃；進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。胞內(nèi)蘋(píng)果酸的提取及樣品預(yù)處理方法參照文獻(xiàn)[14-15]。

甘油測(cè)定：采用HPLC測(cè)定，色譜柱為BioRad Aminex HPX-87H，流動(dòng)相為5 mmol/L稀硫酸；柱溫為 35℃；流速為 0.6 mL/min；進(jìn)樣量為 20 μL；檢測(cè)器為示差檢測(cè)器。

1.3.3 酶活測(cè)定取不同時(shí)期的發(fā)酵液離心棄上清，用0.1 mol/L、pH 8.0的磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，并懸浮于緩沖液中，超聲破碎10 min（工作5 s，間隔 5 s）后，4 ℃，8 000 r/min 離心 3 min，所得上清液用于酶活測(cè)定。蘋(píng)果酸脫氫酶的酶活測(cè)方法定參考文獻(xiàn)[5]。丙酮酸羧化酶的酶活測(cè)定參考文獻(xiàn)[16]。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定，采用改良型Bradford法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（上海生工生物）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Afpyc的表達(dá)對(duì)碳流分布的影響

丙酮酸羧化酶是影響蘋(píng)果酸、富馬酸等二羧酸大量積累的關(guān)鍵因素[5，10]，且其低水平表達(dá)有利于提高目標(biāo)產(chǎn)物[10-17]。前期研究表明，Afpyc基因的中、高水平表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定的抑制作用。因此，考察了Afpyc低水平表達(dá)對(duì)碳流分布的影響。將整合表達(dá)質(zhì)粒pMD19-GMC-Afpyc-18S-TRP，利用限制性?xún)?nèi)切酶SphI和BglII進(jìn)行雙酶切，得到條帶大小分別為6 165 bp和2 692 bp的片段（圖2），表明該整合表達(dá)質(zhì)粒已經(jīng)構(gòu)建成功。將測(cè)序正確的Afpyc基因 （3 582 bp）經(jīng)BamH I、PstI雙酶切后，連接用相同限制酶酶切的表達(dá)載體pY14，經(jīng)雙酶切獲得條帶大小分別為5 414 bp和3 582 bp的片段，表明質(zhì)粒pY14/Afpyc已經(jīng)構(gòu)建成功。利用LiAc轉(zhuǎn)化法，將線性化的質(zhì)粒pMD19-GMC-Afpyc-18STRP和重組質(zhì)粒pY14/Afpyc分別轉(zhuǎn)入菌株tTAM中，篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并分別命名為W002和W003（表 1）。

基因Afpyc的單獨(dú)表達(dá)能夠調(diào)節(jié)碳流分布，降低丙酮酸的積累量，具體表現(xiàn)在 （表3）：1）菌株W002和W003的丙酮酸羧化酶比酶活分別為0.63 U/mg和0.78 U/mg，相對(duì)于對(duì)照組W001分別提高了30倍和38倍，且單獨(dú)表達(dá)Afpyc基因，對(duì)菌體生長(zhǎng)沒(méi)有影響；2）菌株W002、W003的丙酮酸積累量相對(duì)于W001分別降低了29.6%和42.3%；3）分析其他副產(chǎn)物情況可知，菌株W002、W003的α-酮戊二酸 （α-KG）積累量較對(duì)照組W001分別提高了48.1%和79.7%，這可能是由于Afpyc基因的表達(dá)使得丙酮酸的碳流流向草酰乙酸，從而進(jìn)入TCA循環(huán)，導(dǎo)致部分α-酮戊二酸（α-KG）積累[18]。上述結(jié)果表明Afpyc的低水平表達(dá)能夠有效的調(diào)節(jié)丙酮酸節(jié)點(diǎn)的碳流分布，且Afpyc基因的低水平游離表達(dá)效果較好。因此，選擇菌株W003進(jìn)行下一步研究。

2.2 Afmdh的表達(dá)對(duì)碳流分布的影響

為了進(jìn)一步將碳流導(dǎo)向L-蘋(píng)果酸，將測(cè)序正確的Afmdh基因經(jīng)NotI、BglII雙酶切后，連接至相同限制酶酶切的表達(dá)載體pY26，經(jīng)雙酶切獲得條帶大小分別為7 430 bp和996 bp的片段 （圖3（a）），表明重組質(zhì)粒pY26/TEF-Afmdh構(gòu)建成功。利用LiAc轉(zhuǎn)化法，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株W003，獲得菌株W005。

圖2 質(zhì)粒pMD19-GMC-Afpyc-18S-TRP、pY14/Afpyc酶切驗(yàn)證Fig.2 Confirmation of recombinant plasmid pMD19-GMC-Afpyc、pY14/Afpyc

將菌株W005經(jīng)搖瓶發(fā)酵后，研究基因Afmdh的表達(dá)對(duì)碳流分布的影響，結(jié)果如圖3所示：1）菌株W005的蘋(píng)果酸脫氫酶比酶活為0.63 U/mg，細(xì)胞干重DCW為1.54 g/L，比對(duì)照組W004分別提高了350.2%和23.3%；2）發(fā)酵96 h時(shí)，菌株W005積累了1.93 g/L的L-蘋(píng)果酸，但是，其胞內(nèi)L-蘋(píng)果酸濃度達(dá)到了7.52 mg/g DCW，比對(duì)照組菌株W004提高了1.59倍；3）菌株W005的丙酮酸產(chǎn)量為9.03 g/L，相對(duì)于菌株W004降低了62.5%。上述結(jié)果表明，基因Afmdh的表達(dá)有利于菌體生長(zhǎng)，且共表達(dá)基因Afpyc和Afmdh能夠進(jìn)一步將丙酮酸的碳流導(dǎo)向L-蘋(píng)果酸。但是由于菌株W005的胞內(nèi)L-蘋(píng)果酸濃度較高，限制了L-蘋(píng)果酸的進(jìn)一步積累。目前，已有研究表明，蘋(píng)果酸的外轉(zhuǎn)運(yùn)是限制L-蘋(píng)果酸大量積累的一個(gè)關(guān)鍵性因素[5-6，12]，因此，需要強(qiáng)化L-蘋(píng)果酸的外運(yùn)系統(tǒng)，降低胞內(nèi)L-蘋(píng)果酸的積累量，進(jìn)一步提高L-蘋(píng)果酸產(chǎn)量。

表3 Afpyc的表達(dá)對(duì)碳流分布的影響Table 3 Fermentation profiles by overexpressing Afpyc

2.3 Afmae的表達(dá)對(duì)L-蘋(píng)果酸積累的影響

圖3 胞質(zhì)還原路徑對(duì)L-蘋(píng)果酸積累的影響Fig.3 Effect of construct rTCA pathway on the production of L-malate

通過(guò)在菌株W005中過(guò)表達(dá)基因Afmae，強(qiáng)化L-蘋(píng)果酸的外轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，促進(jìn)胞內(nèi)L-蘋(píng)果酸向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)。將測(cè)序正確的Afmae基因經(jīng)EcoR I、XhoI雙酶切后，連接至相同限制酶酶切的表達(dá)載體pY26/TEF-Afmdh，經(jīng)雙酶切獲得條帶大小分別為8 443 bp 和 996 bp 的片段（圖 4（a）），表明重組質(zhì)粒 pY26/TEF-Afmdh-GPD-Afmae構(gòu)建成功。利用LiAc轉(zhuǎn)化法，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株W003，獲得菌株W006。

在此基礎(chǔ)上，分析基因Afmae的表達(dá)對(duì)菌株W006積累L-蘋(píng)果酸的影響，結(jié)果表明：（1）發(fā)酵96 h時(shí)，菌株W006的L-蘋(píng)果酸積累量為2.34 g/L，相對(duì)于 W005提高了 21.2%；（2）菌株 W006的DCW由1.54 g/L提高到1.88 g/L，提高了22.1%；（3）分析其他副產(chǎn)物情況可知，丙酮酸積累量為10.4 g/L，沒(méi)有進(jìn)一步下降（圖 4（b）），且仍然存在少量的α-酮戊二酸（α-KG）和甘油。上述結(jié)果表明，外轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的強(qiáng)化有利于菌體生長(zhǎng)及L-蘋(píng)果酸的積累。

圖4 質(zhì)粒pY26/TEF-Afmdh GPD-Afmae的驗(yàn)證及菌株W006發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸Fig.4 Vertification of plasmid pY26/TEF-Afmdh GPD-Afmae and fermentation performance of strain W006

2.4 接種量對(duì)L-蘋(píng)果酸積累的影響

為了進(jìn)一步提高L-蘋(píng)果酸產(chǎn)量，研究了不同接種量對(duì)L-蘋(píng)果酸積累的影響，結(jié)果如表4所示：1）初始接種量OD600=2時(shí)，L-蘋(píng)果酸的產(chǎn)量最高達(dá)到3.28 g/L，最終菌體DCW為2.34 g/L，單位細(xì)胞產(chǎn)L-蘋(píng)果酸能力（L-malate/DCW）為1.40 g/L/gDCW，較對(duì)照組 （OD600=1）分別提高了40.2%、13.0%和22.8%；2）當(dāng)初始接種量OD600＜2時(shí)，隨著接種量的增加，菌體DCW、L-蘋(píng)果酸產(chǎn)量和L-malate/DCW也隨之提高；3）當(dāng)初始接種量OD600＞2時(shí)，菌體DCW和L-蘋(píng)果酸產(chǎn)量開(kāi)始下降。上述結(jié)果表明，L-蘋(píng)果酸產(chǎn)量提高的原因，一方面是由于菌體DCW的增加，另一方面是由于單位菌體生產(chǎn)能力 （L-malate/DCW）的提高。因此，后續(xù)研究可以通過(guò)濃縮菌體量的方式，進(jìn)一步提高L-蘋(píng)果酸的產(chǎn)量。

表4 接種量對(duì)L-蘋(píng)果酸發(fā)酵的影響Table 4 Effect of initial inoculum on the production of L-malic acid

3 討 論

丙酮酸生產(chǎn)菌S.cerevisiaeTAM能夠積累高濃度的丙酮酸，這為構(gòu)建理性的L-蘋(píng)果酸生物合成路徑，有效地將丙酮酸碳流導(dǎo)向L-蘋(píng)果酸奠定了基礎(chǔ)[5]。本研究構(gòu)建的L-蘋(píng)果酸生物合成路徑涉及2個(gè)關(guān)鍵酶：丙酮酸羧化酶和蘋(píng)果酸脫氫酶，該路徑在理論上能夠?qū)崿F(xiàn)L-蘋(píng)果酸的最大化生產(chǎn)。已有研究表明，丙酮酸羧化酶是高效生產(chǎn)氨基酸和四碳二羧酸的主要代謝瓶頸，因此，該酶也是進(jìn)行基因改造獲取高產(chǎn)菌株的重要靶標(biāo)酶[19-21]。過(guò)量表達(dá)丙酮酸羧化酶能夠有效增強(qiáng)自丙酮酸到草酰乙酸的碳流，從而，一方面增加L-蘋(píng)果酸合成的直接前體，另一方面提高進(jìn)入TCA循環(huán)的碳流[22]。然而，提高的碳流最終并沒(méi)有轉(zhuǎn)變成更多的L-蘋(píng)果酸，其原因可能是蘋(píng)果酸合成路徑的下游草酰乙酸代謝路徑存在著限速步驟[5]。單獨(dú)過(guò)量表達(dá)蘋(píng)果酸脫氫酶，使得由草酰乙酸到L-蘋(píng)果酸的產(chǎn)物代謝流得到了很大的提升[23]。但是，蘋(píng)果酸脫氫酶的過(guò)量表達(dá)大量消耗了胞質(zhì)的NADH，有效地增強(qiáng)了糖酵解的速率[24-25]。綜上所述，結(jié)合丙酮酸羧化酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的特點(diǎn)，本研究通過(guò)過(guò)量表達(dá)丙酮酸羧化酶和蘋(píng)果酸脫氫酶將碳流由丙酮酸導(dǎo)向L-蘋(píng)果酸，成功構(gòu)建了L-蘋(píng)果酸積累的胞質(zhì)還原路徑。

然而，上述路徑并不能有效的將丙酮酸碳流導(dǎo)向L-蘋(píng)果酸，原因在于L-蘋(píng)果酸生物合成路徑中存在著動(dòng)力學(xué)代謝瓶頸。本研究中，通過(guò)測(cè)定胞內(nèi)L-蘋(píng)果酸的含量，發(fā)現(xiàn)菌株W005胞內(nèi)L-蘋(píng)果酸濃度達(dá)到了7.52 mg/g DCW，比對(duì)照組菌株W004提高了1.59倍。上述結(jié)果初步證明了L-蘋(píng)果酸的外轉(zhuǎn)運(yùn)能力弱為關(guān)鍵代謝瓶頸。因此，應(yīng)當(dāng)增強(qiáng)工程菌W005對(duì)二羧酸的轉(zhuǎn)運(yùn)能力以便于競(jìng)爭(zhēng)性轉(zhuǎn)運(yùn)胞質(zhì)中的L-蘋(píng)果酸，提高發(fā)酵液中L-蘋(píng)果酸的積累量。已有研究表明，通過(guò)過(guò)量表達(dá)SpMAE1能夠有效地將胞質(zhì)中的L-蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，使得在發(fā)酵液中積累更多的L-蘋(píng)果酸[26]?；诖?，為了進(jìn)一步提高L-蘋(píng)果酸的產(chǎn)量，將SpMAE1過(guò)量表達(dá)于W005中（即W006），最終使得L-蘋(píng)果酸的產(chǎn)量比W005提高了21.2%。

然而，工程菌W006除了產(chǎn)生L-蘋(píng)果酸外，仍然能夠產(chǎn)生13.94 g/L丙酮酸，及少量的α-酮戊二酸等雜酸，從而大大提高了L-蘋(píng)果酸的下游提取成本，該結(jié)果表明，L-蘋(píng)果酸的生產(chǎn)菌株仍有再次提高的空間。伴隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，系統(tǒng)代謝工程作為一種概念性技術(shù)框架，有效地加速了對(duì)存在路徑的修飾，有效地優(yōu)化了對(duì)目標(biāo)代謝物的生產(chǎn)，為高效改造微生物生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品提供了新的方法[27]。例如，利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組能夠有效深入的分析利用還原路徑生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸所存在的代謝瓶頸。在上述基礎(chǔ)上，利用模塊路徑工程系統(tǒng)性的裝配與優(yōu)化代謝模塊，進(jìn)而精細(xì)化控制已經(jīng)存在的代謝路徑，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)宿主的代謝平衡，進(jìn)而有效地消除代謝瓶頸，改善微生物的細(xì)胞表型[28]。最終，實(shí)現(xiàn)雜酸大幅度降低、L-蘋(píng)果酸大幅度提高，從而有效的降低L-蘋(píng)果酸的下游提取成本。

4 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)在S.cerevisiae中過(guò)量表達(dá)源于A.flavus的丙酮酸羧化酶（Afpyc）、蘋(píng)果酸脫氫酶（Afmdh）及C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Afmae），成功構(gòu)建了L-蘋(píng)果酸合成的胞質(zhì)還原路徑。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化工程菌株W006的發(fā)酵條件，使得L-蘋(píng)果酸的積累量達(dá)到3.28 g/L。本研究為利用異源路徑生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸提供了一種新的借鑒。