程少波，楊 焱，郭敏瑞，江 英，陳國剛

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832000）

庫爾勒香梨屬新疆梨種（Pyrus sinkiangensisyu），是一個(gè)地域性極強(qiáng)的名優(yōu)特優(yōu)良品種。皮薄肉細(xì)，汁多味甜，酥脆爽口，香味濃郁獨(dú)特，因其優(yōu)良的品質(zhì)而遠(yuǎn)銷國內(nèi)外，但近年來，在采后貯藏期間出現(xiàn)的“黑頭病”嚴(yán)重影響庫爾勒香梨的果實(shí)品質(zhì)及其商品價(jià)值。

庫爾勒香梨“黑頭病”癥狀復(fù)雜，其發(fā)病初期僅在果實(shí)的萼部出現(xiàn)黑斑，病斑下果肉完好，隨病變部位不斷由果實(shí)萼部想果心部蔓延擴(kuò)大，繼而病變部位果皮皺縮、果肉變硬，最終呈現(xiàn)深褐色凹陷狀，可以看到明顯菌絲。唐文娟[1]等對“黑頭病”病原菌進(jìn)行分離和形態(tài)學(xué)鑒定，其結(jié)果表明引發(fā)“黑頭病”的病原菌分別屬于枝孢屬（Cladosporium）、青霉屬（Peniccillium）、鏈格孢屬 （Alternaria）和曲霉屬（Aspergillus）。此后，楊焱[2]等又對該病的病原菌進(jìn)行了生物學(xué)特性研究，確定該病菌最佳生長碳源、氮源、溫度以及pH，采用紫外線照射可有效的防治該病的發(fā)生。

變性梯度凝膠電泳 （Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）技術(shù)是目前對微生物群落遺傳多樣性及種群動(dòng)態(tài)性研究的最有效的技術(shù)手段，這種技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于樹木生長環(huán)境[3-4]、動(dòng)物腸道[5-6]、海洋[7-8]、土壤[9]、工業(yè)廢水活性污泥[10]等的檢測與分析中。在食品行業(yè)中，多數(shù)用于發(fā)酵食品的檢測[11]，例如分析酸菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群[12]以及白酒釀造[13]過程中的微生物多樣性等。但關(guān)于此技術(shù)在水果微生物病害方面的研究報(bào)道甚少，可能由于水果中多酚含量較高，在進(jìn)行DNA提取時(shí)會(huì)造成干擾，繼而影響DNA的純度。

本試驗(yàn)采用改良CTAB法（添加PVP：病變果實(shí)中含有酚類，需添加PVP去除多酚類物質(zhì)對DNA純度的影響）對庫爾勒香梨果實(shí)“黑頭病”組織提取DNA，并進(jìn)行DGGE分析，為庫爾勒香梨“黑頭病”的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)所用庫爾勒香梨病梨采自庫爾勒及阿克蘇地區(qū)的冷藏庫和氣調(diào)庫。

PVP：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；β巰基乙醇 ：Scientific Research Specia； 溶 菌 酶 、Tris：Biotopped公司；CTAB：索萊寶生物科技有限公司；RNase：TIANGEN；HCl、NaOH、NaCl、三氯甲烷、異戊醇、無水乙醇、過硫酸銨、甘油、尿素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、EDTA、EDTA-Na2均購于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DGGE儀：美國Bio-Rad公司；PCR儀：TECHNE；冷凍離心機(jī)：Centrifuge 541712；電泳儀DYY-8C型：北京市六一儀器廠；高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；移液槍：Genex Beta。

1.3 方法

1.3.1 庫爾勒香梨“黑頭病”病害組織總DNA的提取病害組織的基因組的DNA的提取在文獻(xiàn)[14]的方法上加以改進(jìn)，在研磨后的樣品中加入等體積的TE緩沖溶液和PVP（K30），混合均勻。提取后將DNA溶解于10 μL RNA酶溶液和50 μL TE緩沖液，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增及DNA檢測選擇真菌18srDNA基因的 PCR引物[15]，上游引物：FR15’-AICCATTCAATCGCTAIT-3’ 下游引物：F F3905’-CGATAACGAACGAGACCT-3’，擴(kuò)增片段大約為390 bp。 PCR 反應(yīng)體系 （25 μL）[16]：12.5 μL Mix，2 μLDNA 模板，引物各 1 μL，ddH2O 7.5 μL。 PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火 1 min，72℃延伸 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中染色劑為Gold View，采用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.3.3 巢式PCR擴(kuò)增及DGGE分析

1） 檢測完成后，上游引物：FR1-GC5’-CGCCC GGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG GGAICCATTCAATCGCTAIT-3’；下游引物：FF3905’-CGATAACGAACGAGACCT-3’。采用與1.2.2節(jié)相同的擴(kuò)增條件及體系對總DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。

2）PCR 產(chǎn)物變性凝膠電泳（DGGE）分析：對病原菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，研究微生物的生物群落構(gòu)成。操作步驟為：配制6%的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為35%～55%。取相應(yīng)比例的凝膠，加入1%過硫酸銨和TEMED，進(jìn)行灌膠。待膠完全凝固（大約5 h），將PCR產(chǎn)物25 μL垂直點(diǎn)入點(diǎn)樣孔中，電泳緩沖液為0.5×TAE溶液（60℃），200 V電壓下預(yù)跑10 min，在60℃、80 V電壓下電泳16 h。電泳結(jié)束后用EB染色，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.3.4 PCR-DGGE電泳圖譜分析群落生態(tài)學(xué)是以群落為研究對象，群落 （即生物群落，Biotic community）是指特定時(shí)間內(nèi)，分布在同一區(qū)域的許多同種生物個(gè)體自然組成的生物系統(tǒng)。群落中物種多樣性的測量方法有多種，本文中主要采用豐度（S）、優(yōu)勢度、Shannon-Wiener指數(shù)（H）以及樣品之間相似性聚類分析（UPGMA）進(jìn)行比較樣品的多樣性。所得的圖像通過美國Bio-Rad公司的Quantity one 4.6.2軟件及Bio-Dap軟件進(jìn)行分析。

1）豐度。采用PCR-DGGE圖譜中條帶的數(shù)量來表示。

2）優(yōu)勢度。應(yīng)用某一特定條帶的峰面積占樣品中總的峰面積的百分比來表示。

3）Shannon-Wiener指數(shù)。

式中：Pi為第i物種所占的百分比，即第i物種的個(gè)數(shù)占中物種總個(gè)數(shù)的百分比；r為樣品中含有的不同物種的總數(shù)量，即樣品中PCR-DGGE圖譜的條帶數(shù)。

4）采用UPGAMA算法進(jìn)行聚類分析，形成相似性分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取及PCR擴(kuò)增檢測

采用真菌通用引物FR1/FF390將提取到的庫爾勒香梨“黑頭病”病變組織總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。得到的基因片段為390 bp。

2.2 香梨“黑頭病”病變組織PCR-DGGE圖譜

按照上述的方法對庫爾勒香梨 “黑頭病”18S rDNA區(qū)間微生物進(jìn)行DGGE圖譜分析，如圖2所示。不同條帶代表病梨樣品中不同菌株類群18S rDNA基因片段，根據(jù)圖2可知，A庫樣品可識(shí)別的條帶分別為6條、7條、9條，B庫樣品可識(shí)別的條帶分別為4條、5條、6條，C庫樣品可識(shí)別的條帶分別為7條、8條、9條，D庫樣品可識(shí)別條帶分別為6條、6條、6條。所有樣品的優(yōu)勢條帶較清晰，說明在聚丙烯酰胺的變性（變性范圍35%～55%）條件下，各個(gè)樣品可以得到較好的分析。

圖1 樣品FR1/FF390引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 DNA of PCR amplification results agarose jel electrophoresis of pathogen

2.3 PCR-DGGE圖譜中條帶豐度變化

庫爾勒香梨“黑頭病”致病菌DGGE圖譜條帶的豐度變化規(guī)律結(jié)果如表1所示。1～12號(hào)樣品是從企業(yè)保鮮庫中隨機(jī)抽取的發(fā)病庫爾勒香梨。1～3號(hào)樣品、4～6 號(hào)樣品、7～9 號(hào)樣品、10～12 號(hào)樣品分別采自A、B、C、D 4個(gè)庫中，各庫樣品病變程度均為逐漸增加。由表1可知，不同樣品的豐度存在一定的差異，其中1號(hào)與10～12號(hào)豐度相同，2號(hào)與9號(hào)豐度相同，5號(hào)、7號(hào)、8號(hào)豐度相同，3號(hào)樣品的豐度最高，4號(hào)樣品的豐度最低。第9號(hào)條帶在所有樣品中均可檢出，并且該條帶優(yōu)勢度最高，表明該條帶代表的菌株類群是庫爾勒香梨“黑頭病”病變組織中共有的一類特征性菌株類群；第4、5、6號(hào)條帶所代表的菌株類群分別在A庫和D庫樣品中檢出，這6個(gè)樣品的腐爛程度不同，但整體病變程度略大于其他樣品；第3號(hào)條帶所代表的菌株類群在A庫中檢出，2號(hào)條帶所代表的菌株類群在C庫中檢出，第1、7號(hào)條帶所代表的菌株類群僅在個(gè)別樣品中檢出。

本試驗(yàn)分析了庫爾勒香梨“黑頭病”病變組織DGGE圖譜的豐度，結(jié)果表明：不同保鮮庫、不同樣品因病變程度不同，圖譜條帶數(shù)存在一定差異，優(yōu)勢條帶在3～9條之間，這些優(yōu)勢條帶既有所有樣品共有的條帶，也有個(gè)別樣品的特異性條帶。樣品可檢出條帶的豐度隨樣品的病變程度的變化而變化?？赡艿脑蚴牵翰煌ｕr庫中的庫爾勒香梨來源不同，內(nèi)生菌存在差異；也可能是因?yàn)椴∽兂潭炔煌蛘咂渌旯餐饔玫慕Y(jié)果?？傮w而言，庫爾勒香梨“黑頭病”病變組織中中真菌結(jié)構(gòu)分布較豐富。

2.4 DGGE圖譜條帶優(yōu)勢度變化規(guī)律

DGGE圖譜中條帶的優(yōu)勢度反映的是該條帶的量在整個(gè)樣品群落中所占比例，即表示樣品群落中各條帶所代表的菌落種類處于何種優(yōu)勢或者劣勢狀態(tài)的群落測定度。對優(yōu)勢度的分析，一定程度上反應(yīng)了香梨“黑頭病”病變組織中真菌群落的變化情況；對條帶之間優(yōu)勢度變化規(guī)律的比較，可以反映優(yōu)勢菌之間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)對病變組織真菌PCR-DGGE圖譜優(yōu)勢度的分析如表1所示，不同樣品相同位置的條帶，優(yōu)勢度存在較大變化，第9號(hào)條帶在所有樣品中均可檢出，根據(jù)該條帶優(yōu)勢度數(shù)據(jù)顯示可知：不同保鮮庫、不同病變程度的該類群微生物出現(xiàn)相對差異，其優(yōu)勢度變化規(guī)律均呈逐漸減低的趨勢。并且該條帶在不同樣品中優(yōu)勢度變化規(guī)律相似，相對其他條帶優(yōu)勢度和變化程度均較大，說明該條帶所代表的真菌可能在香梨“黑頭病”病變組織的微生物系統(tǒng)中起主要作用。

圖2 DGGE指紋圖譜及識(shí)別圖Fig.2 DGGE fingerprinting and recognition

2.5 DGGE圖譜多樣性指數(shù)變化規(guī)律

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（即H值）反映的是群落種類和均勻度的混合參數(shù)：種類數(shù)目越多，樣品多樣性就越多；種類個(gè)體之間的均勻性增加，樣品多樣性也增加。本試驗(yàn)對香梨“黑頭病”病變組織的真菌多樣性進(jìn)行研究，由圖3可知，庫爾勒香梨“黑頭病”病變組織中真菌DGGE圖譜Shannon-Wiener多樣性指數(shù)都在1.10～2.20之間。各保鮮庫中樣品真菌群落多樣性指數(shù)因病變程度不同而不同：A庫中樣品多樣性指數(shù)普遍高于其他庫，其中3號(hào)樣品的多樣性指數(shù)最大，病變最為嚴(yán)重；B庫樣品多樣性指數(shù)略低，4號(hào)樣品的多樣性指數(shù)最小，病變程度最低；C庫樣品隨病變程度的增加多樣性指數(shù)增加；D庫樣品隨病變程度的增加多樣性指數(shù)持平。

表1 庫爾勒香梨“黑頭病”病變組織DGGE的豐度及優(yōu)勢度Table 1 Abundance and dominance of DGGE diagram of the blackhead disease of Korla Fragrant Pear %

圖3 庫爾勒香梨真菌群落多樣性指數(shù)變化規(guī)律Fig.3 Diversity index of fungi in non-nuclear Korla Fragrant Pear

2.6 DGGE圖譜相似性指數(shù)

采用聚類分析法對不同保鮮庫中不同樣品真菌微生物18S rDNA PCR-DGGE圖譜相似性（如圖4所示）進(jìn)行分析。

所有樣品可聚為兩大類，其相似度均在0.7以上，即庫爾勒香梨“黑頭病”病變組織中的真菌類群相似度較高?？赡芩芯昃鶠橐饚鞝柪障憷妗昂陬^病”的致病菌，但因不同菌株的可培養(yǎng)條件不同，在進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，有些菌株無法通過體外培養(yǎng)基培養(yǎng)得到。其中相似性系數(shù)最高的是A庫中1號(hào)和2號(hào)樣品，相似度為0.96；D庫中的11號(hào)和12號(hào)樣品的相似度為0.95；A庫和D庫中的樣品相似度為0.87，其病變程度也比較相似。C庫中9號(hào)和8號(hào)樣品的相似度為0.86，B庫和C庫中樣品的病變程度相似。

2.7 優(yōu)勢條帶序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)各保鮮庫中香梨“黑頭病”病變組織樣品的PCR-DGGE指紋圖譜，對優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收，對條帶進(jìn)行序列測定，將測得的基因序列提交NCBI中檢索，在Gen Bank數(shù)據(jù)庫中通過BLAST工具進(jìn)行同源性比對。結(jié)果表示9號(hào)條帶 （命名為YLB-1）與Alternaria sp.基因序列的同源性為100%（如圖5所示），因此確定造成香梨“黑頭病”的主要菌株屬于真菌界 （Fungi） 半知菌亞門（Deuteromycotina） 絲孢綱（Hyphomycetes） 絲孢目（Hyphomycetales）暗色孢科（Dematiaceae）鏈格孢屬（Alternaria）。

圖4 庫爾勒香梨群落UPGMA聚類分析Fig.4 Dendrogram of the population of Korla Fragrant Pear based on genetic using UPGMA

圖5 DGGE切膠條帶系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogentic tree of the sequences from DGGE bands

3 結(jié)語

香梨“黑頭病”是庫爾勒香梨貯藏期間的一種新型病癥，多發(fā)生在貯藏期半年以上的香梨中，由于“黑頭病”發(fā)病后導(dǎo)致庫爾勒香梨組織衰退，其內(nèi)生菌結(jié)束潛伏作用開始生長所致，目前還未得到有效的防治，研究表明造成該病癥的菌種錯(cuò)綜復(fù)雜，目前發(fā)現(xiàn)的有鏈格孢屬、枝孢屬、青霉屬和曲霉屬，采用傳統(tǒng)的分離方法研究其群落結(jié)構(gòu)過程復(fù)雜，而且容易導(dǎo)致物種多樣性的缺失，本文利用PCRDGGE技術(shù)對庫爾勒香梨“黑頭病”病變組織中真菌群落的研究，從不同保鮮庫樣品的DGGE圖譜可以看出，所有樣品群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異，造成差異的原因可能與庫爾勒香梨的種植環(huán)境有關(guān)，不同生長環(huán)境庫爾勒香梨的內(nèi)生菌有所不同。不同保鮮庫樣品的9號(hào)條帶在整個(gè)病變過程中優(yōu)勢度最高，其代表的菌株，可被認(rèn)為是導(dǎo)致庫爾勒香梨“黑頭病”的主要致病菌，通過對優(yōu)勢條帶進(jìn)行測序，確定其屬于鏈格孢屬（Alternaria），這類菌95%以上的種類兼性寄生于植物上，引起多種植物病害，如小麥葉枯病，蔥紫斑病，玉米大斑病，茄子早疫病等都是鏈格孢菌侵害所造成的，進(jìn)一步了解這類菌侵害植物的原理及發(fā)病機(jī)制，對微生物學(xué)的發(fā)展以和果蔬 貯藏保鮮等方面的應(yīng)用具有重要的意義。