申 晶,苗俊秋,高麗娟,王德平,左 琳,曹濟(jì)民*

(1山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系,太原 030001;2細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:caojimin@126.com)

肥胖是一種重要的代謝疾病,并已逐漸成為日益嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題。肥胖患者往往都患有一系列并發(fā)癥,包括2型糖尿病(T2D)、心血管疾病(CVD)、胃腸道疾病等,這些問題使其死亡風(fēng)險(xiǎn)急劇增加。一般超重可通過適當(dāng)運(yùn)動(dòng)、調(diào)整飲食或藥物等多種方法進(jìn)行控制,而對(duì)于病態(tài)性肥胖,定義為體質(zhì)量指數(shù)(body mess index,BMI)>40 kg/m2或BMI>35 kg/m2合并多種內(nèi)科疾病,這種肥胖采用保守治療很難取得預(yù)期減重效果,而手術(shù)治療是目前治療病態(tài)肥胖的唯一治療方法[1]。根據(jù)其原理減肥手術(shù)可分為三種:減少吸收型、限制攝入型(胃減容術(shù))和混合型手術(shù)。其中Roux-en-Y減重手術(shù)(Roux-en-Y gastric bypass,RYGB)是胃減容術(shù)的一種,它可以重建胃腸道同時(shí)縮小胃容積,被稱為減肥手術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。

本研究收集了6個(gè)接受行RYGB減重術(shù)的肥胖SD大鼠的芯片數(shù)據(jù),利用多種芯片數(shù)據(jù)發(fā)掘工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析,探索胃旁路術(shù)減重大鼠脂肪組織基因表達(dá)的特征以及生物學(xué)意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究所用的表達(dá)譜數(shù)據(jù)(GSE8314),是以美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus database,GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)為數(shù)據(jù)源,設(shè)定“weight loss”為關(guān)鍵詞檢索獲得?；蛐酒畔⑵脚_(tái)為GPL1355,即Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array類型。該數(shù)據(jù)集包含6個(gè)樣本,包括3個(gè)對(duì)照組與3個(gè)實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組為高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的SD大鼠,實(shí)驗(yàn)組為經(jīng)歷胃旁路術(shù)且成功的肥胖SD大鼠,取大鼠的腹部脂肪組織進(jìn)行測(cè)序。

1.2 研究方法

1.2.1 差異基因的篩選 利用R語言中“l(fā)imma”包篩選差異基因[3],篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05和|logFC|>1。

1.2.2 差異基因的GO功能和KEGG Pathway富集分析 采用DAVID在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)差異基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)Pathway富集分析,以P<0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)確定差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過程和通路,尋找可能的作用通路。

1.2.3 差異基因所編碼蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將差異基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org),驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間的相互作用,設(shè)定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為大于0.9,篩選有高密度相互作用的蛋白質(zhì)。并用Cytoscape軟件繪制蛋白質(zhì)相互作用圖。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選結(jié)果

本研究共得到890個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因386個(gè)，下調(diào)基因504個(gè)(見圖1)。取前100個(gè)差異最明顯的基因構(gòu)建分層聚類圖(見圖2)。

圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，其中黑色的點(diǎn)代表表達(dá)無差異的基因，紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因圖1 差異基因的火山圖Figure 1 Volcano plot of the differenrially expressed genes

2.2 差異基因的GO功能和KEGG Pathway富集分析結(jié)果

通過DAVIDE在線軟件對(duì)差異基因進(jìn)行GO分析,結(jié)果見圖3。這些差異基因主要參與25個(gè)生物學(xué)過程,包括膠原纖維組織(GO:0030199)、傷口愈合(GO:0042060)、對(duì)雌二醇的反應(yīng)(GO:0032355)、對(duì)藥物的反應(yīng)(GO:0042493)、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)(GO:0008285)、炎癥反應(yīng)(GO:0006954)等生物學(xué)過程。分子功能主要涉及3個(gè)功能,鈣離子結(jié)合(GO:0005509)、肝素結(jié)合(GO:0008201)、碳水化合物結(jié)合(GO:0030246)。細(xì)胞組分結(jié)果顯示,差異基因主要分布在細(xì)胞外空間(GO:0005615)、細(xì)胞外外泌體(GO:0070062)、細(xì)胞外基質(zhì)(GO:0031012)等12個(gè)細(xì)胞組分(見圖3、表1)。

使用基于KEGG的通路分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因共涉及信號(hào)通路9條,主要的信號(hào)通路有:蛋白質(zhì)消化吸收(rno04974)、細(xì)胞色素P450對(duì)異生素的代謝(rno00980)、藥物代謝-細(xì)胞色素P450(rno00982)、花生四烯酸代謝(rno00590)、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路(rno04920)、化學(xué)致癌作用(rno05204)、ECM-受體相互作用(rno04512)、脂肪因子信號(hào)通路(rno04920)、苯丙氨酸代謝(rno00360)、膽汁分泌(rno04976)(見圖4)。

圖中每列代表樣本，其中前三列代表RYGB減重手術(shù)前肥胖大鼠脂肪組織，后三列代表RYGB減重手術(shù)后肥胖大鼠脂肪組織。每行代表差異基因，顏色由綠到紅代表基因的表達(dá)情況圖2 差異表達(dá)的基因熱圖Figure 2 Heatmap of the differentially expressed genes

圖中每個(gè)柱子代表一個(gè)生物學(xué)功能，其中紅色代表生物過程，紫色代表細(xì)胞組分，綠色代表分子功能。圖3 GO功能富集分析差異基因Figure 3 The result of gene ontology(GO) function analysis of differentially expressed genes

表1 差異基因GO功能富集分析結(jié)果

2.3 差異基因所編碼蛋白質(zhì)的相互作用結(jié)果

將差異表達(dá)基因相對(duì)應(yīng)的蛋白名稱導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,在線分析蛋白-蛋白相互作用,設(shè)定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為大于0.9,篩選高度相互作用的蛋白質(zhì)。并用Cytoscape軟件繪制蛋白質(zhì)相互作用圖。圖中節(jié)點(diǎn)表示差異基因表達(dá)的蛋白,每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系。一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度(Degree)則表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的邊的條數(shù)。根據(jù)節(jié)點(diǎn)的Degree繪制出了前30個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的條形圖,網(wǎng)絡(luò)中以Bdkrb1(count=15),Ccl6(count=15),Pf4(count=15)有較高的節(jié)點(diǎn)值,說明其為蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的中心節(jié)點(diǎn)(見圖5,6)。

圖4 差異基因的Pathway分析Figure 4 Pathway analysis of differentially expressed genes

3 討論

本研究對(duì)RYGB減重手術(shù)前后肥胖SD大鼠脂肪組織的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入挖掘,經(jīng)過R語言處理數(shù)據(jù),結(jié)合DAVIDE、STRING等數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行初步篩選和深入分析,從基因水平揭示了胃旁路術(shù)減重對(duì)機(jī)體的影響,最后得到Bdkrb1、PF4等核心基因。

緩激肽B1受體(bradykinin B1 receptor,Bdkrb1)是G蛋白偶聯(lián)受體超家族A類亞家族的成員。其內(nèi)源性配體緩激肽,是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的一員,在維持心血管穩(wěn)態(tài)、炎癥等生理學(xué)進(jìn)程中起著非常重要的作用[4]。Bdkrb1為誘導(dǎo)性受體,在正常生理狀態(tài)下低表達(dá),在應(yīng)激、炎癥等狀態(tài)下如在肥胖、糖尿病患者中其表達(dá)急劇增高。越來越多的研究表明,Bdkrb1在肥胖以及糖尿病發(fā)生發(fā)展中有著非常重要的作用。在基因型肥胖鼠ob/ob鼠中,Bdkrb1表達(dá)量增加[5]。在Bdkrb1缺乏[6]以及給予Bdkrb1的拮抗劑[7,8]的肥胖鼠模型中,其脂肪含量下降,血中胰島素含量下降,胰島素抵抗及其并發(fā)癥可明顯改善。這一現(xiàn)象是由于在Bdkrb1缺乏的小鼠其體內(nèi)瘦素敏感性增加[6,9],脂肪組織的炎癥受到抑制[6,9]。越來越多的研究證明抑制Bdkrb1的活性能夠改善肥胖,本文的結(jié)論與此一致。隨著抑制Bdkrb1的活性在改善肥胖中作用機(jī)制的進(jìn)一步明確以及Bdkrb1拮抗劑的進(jìn)一步研究,可為臨床上選擇性地干預(yù)Bdkrb1,優(yōu)化肥胖及其并發(fā)癥治療的措施提供理論基礎(chǔ)。

圖5 差異基因表達(dá)蛋白相互作用節(jié)點(diǎn)數(shù)Figure 5 Counts of the differentially expressed genes in PPI network

血小板第4因子(platlet factor 4,PF4)又稱CXCL4(Chemokine(C-X-C motif)ligand 4),是一種在巨核細(xì)胞中合成后,由激活的血小板a顆粒分泌的特異性蛋白質(zhì),也是體內(nèi)血小板激活的特異性指標(biāo)。作為血小板活化的標(biāo)記物及活化后釋放的含量最豐富的活性因子之一,PF4已被證實(shí)在促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成中起著重要的作用[10]。Ohkura等[11]發(fā)現(xiàn)在ob/ob鼠中,其血漿中PF4含量顯著增加。肥胖的兒童患者在低熱量飲食3周后,體重下降,其血漿中PF4含量也明顯下降[12]。說明PF4可能會(huì)影響機(jī)體的糖脂代謝,提示其在肥胖發(fā)生發(fā)展中的重要作用。但目前的研究還未闡明其具體機(jī)制。Vandercappellen等[13]研究發(fā)現(xiàn),PF-4/CXCL4能夠影響單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活、分化和遷移,并能夠抑制機(jī)體的血管生成。而肥胖作為一種與慢性輕度炎癥相關(guān)的疾病[14],與脂肪組織中血管的生成一樣是肥胖發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]。目前抗血管生成化合物被用作可能的抗肥胖和抗糖尿病治療的新方法[16]。這些研究均提示,PF4有望成為治療肥胖的新靶點(diǎn)。

目前手術(shù)治療是治療病態(tài)性肥胖及其并發(fā)癥唯一的有效手段。研究發(fā)現(xiàn),減重手術(shù)不僅能夠降低胃容積限制吸收,并且能夠改善機(jī)體能量代謝。在本研究中,通過挖掘行RYGB減重手術(shù)前后肥胖SD大鼠脂肪組織芯片的基因表達(dá)數(shù)據(jù),并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析,從而進(jìn)一步了解減重手術(shù)改善代謝的潛在機(jī)制,以其發(fā)現(xiàn)在肥胖發(fā)生發(fā)展過程中的一些關(guān)鍵因子,為臨床治療提供一定的參考。