張明萌,饒敏臘,劉亭亭,陳藝琳,趙 威,廖小欣,李曉毅,彭健愉,劉新光,5,孫雪榮*

(1廣東醫(yī)科大學廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室,衰老研究所,東莞 523808;2廣東醫(yī)科大學藥學院;3廣東醫(yī)科大學第二臨床學院;4廣東醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院;5廣東醫(yī)科大學生物化學與分子生物學研究所;*通訊作者,E-mail:xuerongsun@126.com)

脂肪干細胞(ADSCs)是從脂肪組織中分離得到的間充質(zhì)干細胞,具有自我更新和向脂肪、骨骼、軟骨、肌肉等多向分化的潛能[1,2]。在機體衰老過程中,體內(nèi)干細胞也會出現(xiàn)衰老、凋亡和數(shù)量減少,并最終導致機體功能受損[3]。

細胞衰老是指細胞周期的永久停滯,并常伴隨體積增大,衰老染色陽性及功能失調(diào)等變化[4],是細胞常見的生物學功能之一。衰老的發(fā)生機制常與持續(xù)的DNA損傷反應(DNA damage response,DDR)有關,同時伴隨細胞分泌功能增加,即所謂的衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)[5]。SASP因子種類復雜多樣,主要包括趨化因子、生長因子、促炎因子等。這些因子可以根據(jù)所處環(huán)境的不同對機體產(chǎn)生正面或負面影響,例如促進組織修復、抑制腫瘤發(fā)展或導致機體慢性炎癥及衰老相關疾病的發(fā)生[6]。

建立簡單有效的細胞衰老模型,將有利于衰老機制及抗衰老研究。文獻報道,多種抗癌藥物能夠通過誘導DNA損傷,導致細胞衰老[7]。絲裂霉素(mitomycin,MMC)是一種從放線菌培養(yǎng)液中分離出的抗腫瘤藥物,可抑制DNA和RNA的合成,而誘導細胞凋亡[8]。MMC也可以導致細胞DNA損傷和氧化應激[9,10]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),MMC可以誘導小鼠NIH-3T3細胞出現(xiàn)典型的衰老表型,并伴隨SASP的發(fā)生[11]。鑒于此,本研究擬用MMC誘導ADSCs衰老,并檢測衰老相關指標,以期建立一種簡單有效的ADSCs衰老模型。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)和處理

ADSCs細胞由本實驗室保存。本研究選用P6代ADSCs,復蘇后用低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司),含2%B27(Gibco公司)和10%胎牛血清(FBS,Hyclone公司),于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),每3 d更換一次培養(yǎng)基。當細胞長到80%-90%融合時,用胰蛋白酶(Gibco公司)進行常規(guī)消化并傳代。用PBS將MMC(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)配制成1 mg/ml的儲存液,避光保存。

1.2 β-半乳糖苷酶(β-gal)活性染色檢測細胞衰老表型

分別用0.5 μg/ml,1 μg/ml和3 μg/ml的MMC處理ADSCs,每組設三個復孔,24 h后撤去MMC更換為新鮮生長液,并繼續(xù)培養(yǎng)到7 d,與正常培養(yǎng)的ADSCs同時進行β-gal染色。根據(jù)β-gal染色試劑盒說明書(Beyotime公司),將細胞用PBS洗滌3次,加β-gal染色固定液,室溫固定15 min,吸出細胞固定液后再用PBS洗滌三次。加入提前配好的染色工作液(A液:1%;B液:1%;C液:93%;X-gal溶液:5% ),37 ℃避光孵育過夜。24 h后于顯微鏡下觀察并拍照。隨機選取5個視野,計數(shù)藍染細胞并計算百分率。

1.3 高通量RNA芯片篩選衰老ADSCs的差異表達基因

將正常培養(yǎng)的ADSCs和0.5 μg/ml MMC處理的ADSCs分別提取細胞RNA進行芯片檢測。采用Agilent Feature Extraction軟件分析芯片圖像文件,利用GeneSpring V13.0軟件(Agilent)對數(shù)據(jù)進行歸一化校正處理分析。選取差異基因表達倍數(shù)變化2倍以上,t檢驗P<0.05的基因進行進一步分析。

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測差異表達的衰老相關基因表達量

根據(jù)說明書,用TRIzol?(Life公司)分別提取正常培養(yǎng)和0.5 μg/ml MMC處理的細胞總RNA,并檢測RNA濃度及純度。用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa公司)反轉錄合成cDNA,并以其為模版進行擴增。使用SYBRTMSelect Master Mix試劑盒(Applied Biosystems公司)在LightCycler?96實時定量PCR儀(Roche公司)中進行PCR反應,反應體系為10 μl,其中SYBR Green qRCR混合液5 μl,上下游引物各0.5 μl,滅菌水3.25 μl,cDNA模板0.75 μl。以GAPDH作為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

1.5 樣品制備和ELISA檢測衰老相關蛋白的分泌

ADSCs用MMC處理24 h后更換正常培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)7 d后收集上清液,底層細胞進行計數(shù)。將收集的上清液在低溫下離心,除去沉淀,進行ELISA檢測。ELISA檢測方法參照武漢博士德生物工程有限公司提供的IL-8(EK0413)和IL-1α(EK0389)ELISA試劑盒的說明書。最后在450 nm波長處檢測吸光度,并根據(jù)標準曲線計算樣本的濃度。

表1 本研究涉及的引物序列

1.6 Western印跡分析檢測p21和γ·H2AX的表達

將收集的蛋白以每孔15 μl加入到提前制好的蛋白膠孔中,經(jīng)SDS-PAGE分離膠進行電泳分離,隨后在250 mA、1.5 h的濕轉條件下將蛋白轉移至PVDF膜(Millipore公司)上,用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h后分別與p21(1 ∶2 000稀釋)抗體和γ·H2AX(1 ∶1 000稀釋)抗體進行雜交,4 ℃孵育過夜。次日用TBST漂洗3次后與辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶5 000稀釋)進行雜交,室溫孵育1 h后用TBST漂洗3次。接著,使用ECL發(fā)光液(Thermo公司),使用可見熒光免疫印跡成像系統(tǒng)儀Azure c400成像系統(tǒng)(Azure Biosystems公司)對蛋白表達水平進行檢測。

Tubulin抗體作為內(nèi)參,購自Invitrogen公司(A11126),p21抗體(#2946)和γ·H2AX抗體(#2577)購自Cell Signaling Technology公司。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 MMC誘導ADSCs出現(xiàn)衰老表型

為了研究MMC是否可以誘導ADSCs衰老,我們分別用三種不同濃度的MMC處理ADSCs,24 h后撤去MMC更換為新鮮生長液,并繼續(xù)培養(yǎng)到7 d進行β-gal染色。結果顯示,MMC處理后7 d,ADSCs體積呈不同程度增大,增殖明顯減慢,同時β-gal染色陽性細胞顯著增多(見圖1A)。三種濃度MMC均可誘導類似的表型改變,0.5 μg/ml和1 μg/ml MMC處理組ADSCs藍染細胞百分率分別為80.8%和82.5%,3 μg/ml MMC組細胞藍染率略低,約為70.2%,均顯著高于對照組(P<0.01,見圖1B)。因此,我們選取0.5 μg/ml MMC進行后續(xù)實驗。

圖1 MMC處理誘導ADSCs出現(xiàn)細胞衰老表型Figure 1 MMC induced a senescent phenotype in ADSCs

2.2 高通量RNA芯片篩選衰老ADSCs的差異表達基因

為了探究衰老ADSCs的差異表達基因,我們將正常培養(yǎng)和MMC誘導衰老的ADSCs分別進行芯片檢測,并對差異基因進行聚類分析。散點圖顯示,經(jīng)MMC處理后,衰老ADSCs表達上調(diào)的基因有691個,下調(diào)的基因有589個(見圖2)。差異基因通路富集分析發(fā)現(xiàn),變化最顯著的前3個通路分別為細胞周期、有絲分裂及分裂M期,提示細胞發(fā)生了周期阻滯,同時DNA甲基化相關基因也有富集(見圖3)。特別值得注意的是,與炎癥相關的SASP基因也有明顯富集,提示衰老ADSCs伴隨著分泌功能的改變。

圖2 MMC處理前后ADSCs差異表達基因的散點圖Figure 2 Scatter plot of differential gene expression in ADSCs before and after MMC treatement

圖3 MMC處理前后ADSCs差異表達基因的通路富集Figure 3 Pathway enrichment of differential gene expression in ADSCs before and after MMC treatment

2.3 衰老ADSCs表達SASP及其他衰老相關基因的檢測

為進一步了解衰老ADSCs的基因表達特征,我們檢測了常見的SASP基因(IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β和TNF-α)及其他衰老相關基因(p16,p21,p53)的表達情況。定量RT-PCR結果顯示,相比對照組ADSCs,衰老ADSCs表達SASP基因IL-1α和IL-1β顯著增高(P<0.05);IL-6和IL-8也是常見的SASP基因,其表達亦明顯上調(diào),但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而TNF-α有輕度降低,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。細胞衰老相關基因p16,p21,p53在mRNA水平均無明顯變化(見圖4A)。

為了檢測上述基因在蛋白水平的變化,我們分別收集兩組ADSCs培養(yǎng)上清液,并用ELISA檢測IL-8及IL-1α的分泌水平。結果顯示,衰老ADSCs分泌IL-8及IL-1α均有一定增強,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖4B)。我們用H2O2處理的ADSCs作為陽性對照,Western blot檢測發(fā)現(xiàn),MMC誘導的ADSCs表達γ·H2AX和P21蛋白明顯上調(diào)(Tubulin作為內(nèi)參)(見圖4C),表示發(fā)生了DNA雙鏈斷裂和細胞周期阻滯,從而導致細胞衰老的發(fā)生。

與對照組相比,*P<0.05圖4 MMC處理后的脂肪干細胞表達SASP及衰老相關基因的變化Figure 4 Expression of SASP and senescence-related genes in senescent ADSCs after treatment with MMC

3 討論

ADSCs在體內(nèi)和體外均可發(fā)生細胞衰老。衰老ADSCs會出現(xiàn)一系列改變,包括分化潛能的改變及生理功能失調(diào),從而引起機體代謝失調(diào)或疾病[12]。因此,建立簡單易行的ADSCs衰老細胞模型,深入研究ADSCs發(fā)生衰老的機制,可為延緩ADSCs衰老奠定基礎。

SASP是衰老細胞常見的特征,衰老細胞通過分泌多種SASP因子,對局部或全身產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。SASP產(chǎn)生的機制主要包括持續(xù)的DDR[13],p38MAPK的激活[14],NF-κB通路的激活[15]等。IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β、TNF-α均屬于SASP中的促炎細胞因子,其中IL-6、IL-8表達最為普遍[16],IL-1α既屬于SASP的重要成員,同時也可以調(diào)節(jié)其他SASP因子的表達[17]。細胞衰老通常伴隨p53/p21或p16/Rb通路的激活,p16、p21是衰老中細胞周期停滯的主要驅動因子,通常被視為衰老的特異性標記[18,19]。

MMC作為一種抗腫瘤藥物,可以引起細胞發(fā)生化療誘導的衰老[7]。本研究發(fā)現(xiàn),MMC可通過誘導DNA損傷,上調(diào)p53/p21通路,而促進ADSCs衰老。衰老ADSCs表現(xiàn)為細胞體積增大,β-gal染色陽性,細胞周期阻滯,并出現(xiàn)細胞周期及DNA甲基化基因等變化。同時,衰老ADSCs具有一定的SASP現(xiàn)象,表現(xiàn)為IL-1α和IL-1β表達升高,但相對我們前期研究的黑色素瘤細胞,SASP相對較弱[20]。在蛋白水平IL-1α升高不顯著,可能是由于實驗重復次數(shù)尚不足。本研究中,我們發(fā)現(xiàn),在mRNA水平,衰老ADSCs細胞p21mRNA無顯著變化,但蛋白水平有明顯上升,提示MMC處理后,P21蛋白穩(wěn)定性增強。

總之,本研究建立了一種簡單有效的ADSCs衰老模型,可在一周左右造成細胞衰老。該模型具有較典型的衰老表型,穩(wěn)定性較好,可作為后續(xù)研究ADSCs衰老機制的基礎,為篩選抗衰老藥物等提供便利。