【疑問1】甲基綠和派若寧（吡羅紅）染色的具體原理是什么？

Bracher于上個世紀40年代建立了甲綠-派若寧染色以來，一直是對比顯示DNA和RNA分布的經(jīng)典染色方法，廣泛應用于教學、科研和臨床診斷。

染色原理：甲綠（Methyl green甲基綠）和派若寧屬于堿性染料且在水中電離后均為帶正電荷的染料，甲綠帶有兩個正電荷，派若寧則帶有一個正電荷。DNA和RNA都有磷酸基和堿基，為兩性電解質，有一定的等電點。染色中兩種染料通過競爭性作用分別與相應的核酸成分結合。

堿性較強的甲基綠與DNA反應（pH為3.8～4.2）使兩個正電荷間的距離與DNA的磷酸基間的距離相當（見圖），每個甲基綠分子中兩個帶正電荷的氮原子分別與DNA分子雙鏈之中每條鏈的每一螺旋中的一個磷酸根相結合，這就是兩者結合的基礎[1]。甲基綠與DNA結合關鍵在于DNA分子的雙螺旋空間構型的完整性，只要雙螺旋構型略有改變，立即引起甲基綠與DNA的結合能力降低。

堿性較弱的派若寧與RNA結合（pH為4.6～5.2）也正好符合RNA的聚合度范圍。也有人提出：甲綠-派若寧染色與DNA和RNA的聚合程度有關。甲綠對聚合程度高的DNA有較強的親和力，而吡羅紅對聚合程度低的RNA有親和力。

圖 甲基綠和派若寧分子結構

【疑問2】甲基綠和吡羅紅能不能單獨使用以鑒定DNA和RNA呢？

教材中提到的甲基綠和吡羅紅混合染色劑指的是A液20 mL（甲基綠和吡羅紅水溶液）和B液80mL（醋酸緩沖液，pH=4.8的溶液）配制的混合染色液。教材中同時使用甲基綠和吡羅紅混合染色劑的意圖是將細胞染色，并可同時顯示DNA和RNA在細胞中的分布，從而形成對比達到實驗目的。

根據(jù)甲基綠和吡羅紅染色原理可知，二者可以單獨去鑒定、提純DNA或RNA。若單獨使用會分別將他們?nèi)境删G色或紅色，但是無法顯現(xiàn)出DNA和RNA在細胞中的分布情況。

【疑問3】為什么甲基綠和吡羅紅混合染色劑為pH=4.8左右？

醋酸和醋酸鈉緩沖液的pH約為4.8左右，在此pH條件下能夠保持DNA分子的空間結構，穩(wěn)定甲基綠和吡羅紅染色劑的結合能力。若pH偏高或偏低均會對DNA和RNA的結構造成一定的破壞，從而對染色效果有一定的影響。

【疑問4】為何選用濃度為8%的鹽酸？

根據(jù)人教版教材必修1第26頁內(nèi)容可知，鹽酸的作用是加速染色劑進入細胞，同時使染色質中的DNA與蛋白質分離，有利于與染色劑結合。而教材中提出的染色液最佳pH約為4.8左右，鹽酸濃度可能為本實驗的關鍵影響因素，如：鹽酸濃度過高，或者沖洗裝片不徹底等因素均會導致pH低于4.8，從而影響觀察的效果。

新疆師范大學生命科學院王佳等人做過相關的探究實驗：不同鹽酸濃度對細胞核染色效果的影響[2]，相關內(nèi)容見表：

表 不同條件下人的口腔上皮細胞染色現(xiàn)象

通過上述實驗結果可以看出，教材提出的8%的鹽酸濃度染色效果不是最佳，反而是2%的鹽酸濃度染色效果更好，可能的原因是8%的鹽酸濃度使pH過低，導致DNA發(fā)生酸水解，同時北京第一中學的李鑫也做了此改進實驗的探究[3]：在不使用鹽酸水解，直接染色的條件下，實驗效果也比較理想。