黃寧江（通訊作者） 黃仕芳 姜卓 胡昊良 徐嬋

（1永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 湖南 永州 425000）

（2永州市第一人民醫(yī)院 湖南 永州 425000）

（3湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 湖南 長沙 41081）

高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocysteinemia，HHcy）是導(dǎo)致心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[1-2]。目前認(rèn)為HHcy與動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）、血栓性疾病密切相關(guān)，但是HHcy導(dǎo)致AS的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，HHcy致病的病理學(xué)基礎(chǔ)主要與同型半胱氨酸（homocysteinemia，Hcy）在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成同型半胱氨酸硫內(nèi)酯（homocysteine thiolactone，HTL）有關(guān)[3]，HTL能導(dǎo)致血管損傷，但具體機(jī)制尚未明確。他汀類藥物是臨床常用治療高膽固醇血癥的藥物，除了有調(diào)血脂的作用外，還具有改善內(nèi)皮功能[4]、抗血管炎癥等非調(diào)脂性作用。文獻(xiàn)報(bào)道，他汀類對HHcy引起的血管內(nèi)皮功能損傷有保護(hù)作用。洛伐他?。╨ovastatin，LVT）是臨床用于治療高膽固醇血癥的他汀類藥物之一，本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LVT可顯著減輕HTL對EDR的抑制作用，減少血管組織中丙二醛的生成和保護(hù)SOD的活性，但LVT對HTL所致血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VEC）損傷的保護(hù)作用及機(jī)制目前尚不清楚。本研究將在前期工作的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討LVT對HTL所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，也為他汀類藥物抗AS作用提供新的依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 主要試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVECs）購自中國典型培養(yǎng)物保藏上海中心細(xì)胞庫；LVT、HTL和DMEM培養(yǎng)基等均購自Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司。熒光定量PCR引物（IL-l序號為Hs00174097，IL-6序號為Hs00l74131，GAPDH序號為4326317E-0503008）均購Applied Biosystems公司。蛋白定量檢測（BCA）試劑盒、蛋白裂解液、IL-1和IL-6單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基在37℃條件下用含5%CO2的孵箱培養(yǎng)。當(dāng)HUVECs長到對數(shù)期時(shí)換成含0.5%FBS的F12K培養(yǎng)基預(yù)處理24h使HUVECs出現(xiàn)同步化，然后用于下一步的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)共分為對照組、HTL處理組（1mmol/L的HTL處理24h）和低濃度LVT處理組（先用0.025μmol/L的LVT預(yù)處理HUVECs4h，然后再用1mmol/L的HTL處理24h）、中濃度LVT處理組（先用0.05μmol/L的LVT預(yù)處理HUVECs4h，然后再用1mmol/L的HTL處理24h）和高濃度LVT處理組（先用0.1μmol/L的LVT預(yù)處理HUVECs4h，然后再用1mmol/L的HTL處理24h）。

1.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量測定

各組處理后的HUVECs細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化（0.125%的胰酶與0.02%的EDTA比例為1∶1），然后用無血清的F12K培養(yǎng)基洗3次，并用PBS重懸細(xì)胞（4×108/L）。加入用1μL無水乙醇配置的DCFH-DA，于37℃避光水浴30分鐘。采用儀器檢測各組HUVECs細(xì)胞的活性氧含量。

1.4 Western Blotting分析IL-1和IL-6蛋白表達(dá)水平

收集各組HUVECs后加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞收取總蛋白，各組的蛋白濃度采用BCA法進(jìn)行測定。每孔上樣蛋白量為30μg，用SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后用無脂奶粉（5%）于常溫下封閉1h。加入不同濃度稀釋的抗IL-1、IL-6和GAPDH等一抗，在4度下?lián)u床過夜。用1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗于室溫下孵育1h，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，對膠片進(jìn)行定影和顯影，最后對膠片掃描并進(jìn)行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間的統(tǒng)計(jì)比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）對多組間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 LVT抑制HUVECs中HTL誘導(dǎo)的ROS的生成

與對照組相比，HTL能明顯誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞內(nèi)ROS生成（P＜0.05）；與HTL組相比，LVT可呈濃度依賴性抑制HTL所致的效應(yīng)（P＜0.05），見圖1。

圖1 洛伐他汀抑制HUVECs中HTL誘導(dǎo)的ROS

2.2 LVT抑制HUVECs中HTL誘導(dǎo)的IL-1的表達(dá)

與對照組相比，HTL能明顯誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞中IL-1表達(dá)；與HTL組相比，LVT可呈濃度依賴性抑制HTL所致的效應(yīng)（P＜0.05），見圖2。

圖2 洛伐他汀抑制HUVECs中HTL誘導(dǎo)的IL-1

2.3 LVT抑制HUVECs中HTL誘導(dǎo)的IL-6的表達(dá)

與對照組相比，HTL能明顯誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞中IL-6表達(dá)與HTL組相比，LVT可呈濃度依賴性抑制HTL所致的效應(yīng)（P＜0.05）見圖3。

圖3 洛伐他汀抑制HUVECs中HTL誘導(dǎo)的IL-6

3.討論

文獻(xiàn)報(bào)道，HTL可通過直接以及間接這兩種途徑影響血管內(nèi)皮功能。HTL的酐鍵可與血漿蛋白的賴氨酸ε-氨基起作用，從而改變蛋白的結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)。間接途徑與HTL影響細(xì)胞內(nèi)信號通路激活有關(guān)，可能與HTL促進(jìn)脂質(zhì)過氧化物和細(xì)胞內(nèi)ROS生成有關(guān)，但具體的分子機(jī)制目前尚未清楚。在本研究中，我們?nèi)TL處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）復(fù)制內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，將HUVECs分為對照組、HTL處理組、低濃度LVT處理組、中濃度LVT處理組和高濃度LVT處理組，用Westernblot檢測HTL及LVT對HUVECs中IL-1和IL-6表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HTL可明顯增加HUVECs內(nèi)ROS生成，同時(shí)可使IL-1和IL-6的蛋白表達(dá)水平均明顯增高，而LVT可呈濃度依賴性抑制HTL誘導(dǎo)的HUVECs中IL-1、IL-6的表達(dá)。

動(dòng)脈粥樣硬化是一種脂質(zhì)代謝失調(diào)以及炎癥性血管病變，AS的發(fā)生進(jìn)展過程中均伴有炎癥反應(yīng)，大量研究表明有許多炎癥因子以及炎癥細(xì)胞參與了AS的形成，如高水平的急性反應(yīng)蛋白和IL-6可促使AS斑塊的形成。研究中，我們發(fā)現(xiàn)LVT可通過下調(diào)HTL誘導(dǎo)的HUVECs中IL-1和IL-6的表達(dá)，參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，從而推測他汀類藥物可能通過減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制AS的形成和發(fā)展，其精確的機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。該研究手段為研究HHcy致病機(jī)制提供了新的方法，其結(jié)果也為他汀類藥物的抗AS作用提供新的依據(jù)。