李慧穎，陸潭麗，王 進(jìn)

（廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021）

帕金森病（PD）是第二大神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于65歲以上人群［1］。大多數(shù)PD患者為散發(fā)的特發(fā)性PD，其發(fā)生考慮與環(huán)境、遺傳因素之間的相互作用有關(guān)。PD的神經(jīng)病理特征包括中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的丟失和含有α－突觸核蛋白的路易小體的蓄積［2］。廣西具有豐富的錳礦資源，然而過量的錳暴露是一種公認(rèn)的環(huán)境健康危險(xiǎn)因素，可誘導(dǎo)類似帕金森病的錐體外系功能異常［3］。環(huán)境錳污染及其引起的中毒性帕金森綜合征是一個重要的公共衛(wèi)生問題，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。線粒體通過不斷分裂和融合，可控制細(xì)胞的大小、形態(tài)和數(shù)量，以維持細(xì)胞的正?；顒樱?］。線粒體的穩(wěn)態(tài)被破壞和線粒體功能紊亂在神經(jīng)退行性疾病的病理生理過程中起著重要作用，進(jìn)一步凸顯了這些細(xì)胞器的重要性，特別是在神經(jīng)元中的重要性［5］。而在神經(jīng)組織中，錳對線粒體具有特殊親和力，會特異性蓄積在富含線粒體的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)突觸中，最終導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和病理損傷。本研究旨在探討錳中毒對SH－SY5Y細(xì)胞多巴胺分泌以及線粒體動力學(xué)的影響，為錳中毒性帕金森綜合征的病理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 氯化錳 （MnCl2）購于美國Sigma公司（批號：WXBC7094V）；胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司（批號：1982158C）；DMEM基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基購于美國Corning公司（批號：08018008）；胰酶（批號：20180506）、1%青－鏈霉素（批號：20180602）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：20180807）均購于北京索萊寶科技有限公司；人多巴胺酶聯(lián)免疫試劑盒購于CUSABIO技術(shù)有限公司（批號：C123060148）；β－actin（14）、LC3（11）、Mfn1（1）、Mfn2（3）、Drp1（3）抗體及熒光二抗（9）均購于美國CST公司；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：P0012S）；CCK－8試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所（批號：LQ732）。ELX800型酶標(biāo)儀產(chǎn)于美國Bio－Tek公司；PowerPac Basic型電泳儀產(chǎn)于美國Bio－Rad公司；9120型Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)產(chǎn)于美國LI－COR Biosciences公司。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH－SY5Y獲贈于中山大學(xué)肖友生博士。細(xì)胞置于含有10%FBS及1%青－鏈霉素的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取對數(shù)生長期SH－SY5Y細(xì)胞（500μmol/L為預(yù)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞自噬的最佳濃度），加入含500μmol/LMnCl2的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h作為MnCl2組，而用不含MnCl2的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的細(xì)胞作為正常對照組［6］。

1.4 細(xì)胞毒性測定 采用CCK－8法檢測不同濃度MnCl2作用于SH－SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活力。將SHSY5Y細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用含不同濃度MnCl2（0μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500 μmol/L、1000μmol/L和2000μmol/L）的培養(yǎng)基處理細(xì)胞24h。干預(yù)結(jié)束后，每孔加入含10μl CCK－8溶液的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2h。最后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度值。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為 IC（%）＝［（As－Ab）/（Ac－Ab）］×100%。As：實(shí)驗(yàn)孔（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK－8、MnCl2）；Ac：對照孔（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK－8，不含 MnCl2）；Ab：空白孔（不含細(xì)胞和 MnCl2的培養(yǎng)基、CCK－8）。

1.5 ELISA檢測多巴胺（DA）含量 將SH－SY5Y細(xì)胞在冰上清洗后移入離心管中，用1×PBS（pH7.2～7.4）稀釋至濃度 100 million/ml，將 SH－SY5Y 細(xì)胞懸液放入－20℃冰凍24 h后經(jīng)室溫解凍，經(jīng)2輪反復(fù)凍融破壞細(xì)胞膜后，于2～8℃5 000 g離心5 min，取上清液即刻進(jìn)行ELISA檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 Western Blot法檢測 LC3、Mfn1、Mfn2 及 Drp1蛋白表達(dá) SH－SY5Y細(xì)胞用冰PBS清洗2次，冰上裂解并收集細(xì)胞，離心后收集上清液即為組織蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，煮沸使蛋白變性；用SDSPAGE 分離蛋白（美國 Bio－Rad，恒壓 140 V，1 h），將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉0.5 h；TBST洗膜3次，分別加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入二抗于室溫下孵育1 h，免疫印跡顯色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用組間差異經(jīng)單因素方差分析及兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MnCl2對SH－SY5Y細(xì)胞存活率的影響 見表1。檢測結(jié)果顯示，125～2 000μmol/L的 MnCl2對SH－SY5Y的增殖抑制作用呈濃度依賴性，不同濃度MnCl2對SH－SY5Y細(xì)胞的增殖均起到明顯抑制作用。MnCl2作用24 h抑制SH－SY5Y增殖的IC50濃度為 587.21±15.02 μmol/L。

表1 MnCl2對SH－SY5Y細(xì)胞存活率的影響 （x±s）

2.2 MnCl2對SH－SY5Y細(xì)胞多巴胺的影響 與正常對照組相比較，MnCl2組的多巴胺分泌量顯著減少（P＜0.05），見表 2。

表2 MnCl2對SH－SY5Y細(xì)胞多巴胺的影響 （x±s）

2.3 MnCl2對 SH －SY5Y 細(xì)胞 Mfn1、Mfn2、Drp1及 LC3蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組相比較，Mn－Cl2組的LC3－Ⅱ表達(dá)明顯增加 （P＜0.05），Drp1表達(dá)明顯降低（P＜0.05），Mfn1 及Mfn2表達(dá)明顯增加（P＜0.05），見圖 1、表3。

圖1 WB檢測各蛋白含量結(jié)果

表 3 MnCl2對 SH－SY5Y 細(xì)胞 Mfn1、Mfn2、Drp1及 LC3蛋白表達(dá)的影響 （%，x±s）

3 討論

慢性過量的錳暴露可促進(jìn)中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失，因此錳中毒被認(rèn)為與帕金森病有關(guān)。與其他類型的細(xì)胞相比，神經(jīng)元的高能量需求不成比例，盡管大腦神經(jīng)元只占身體總量約2%，但其可以消耗多達(dá)20%的人體總能量［7］。這些不尋常的能量需求是由神經(jīng)傳遞及其相關(guān)細(xì)胞過程（維持靜息膜電位、恢復(fù)突觸后受體的離子平衡、通過Na＋和Ca2＋泵在動作電位后恢復(fù)）以及一系列其他間接相關(guān)的內(nèi)務(wù)過程（如脂質(zhì)和蛋白質(zhì)合成和周轉(zhuǎn)、小泡運(yùn)輸或微管和肌動蛋白動力學(xué)）造成的［8］。這些廣泛的能量需求主要是通過TCA循環(huán)和線粒體中的OXPHOS產(chǎn)生ATP來滿足的，因此，這些通路的紊亂可能對神經(jīng)元產(chǎn)生特別的影響。生物化學(xué)證據(jù)表明，腦ATP的大部分用于神經(jīng)元的神經(jīng)電活動［9］。因此，線粒體提供足夠的能量對神經(jīng)元的興奮性和存活至關(guān)重要。與其它細(xì)胞器相比，線粒體在生理和病理?xiàng)l件下經(jīng)常發(fā)生形態(tài)變化［10］。具體而言，線粒體動力學(xué)（融合和分裂）調(diào)節(jié)線粒體網(wǎng)絡(luò)連接，這取決于細(xì)胞的具體代謝需要。

帕金森病的神經(jīng)生化改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部、藍(lán)斑神經(jīng)元脫失致上述部位及其神經(jīng)末梢處多巴胺減少，多巴胺減少≥70%時(shí)會產(chǎn)生帕金森綜合征臨床表現(xiàn)［11］。本實(shí)驗(yàn)對SH－SY5Y細(xì)胞的多巴胺分泌量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)錳處理過的SH－SY5Y細(xì)胞多巴胺分泌量顯著減少，提示錳中毒會導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元受損，導(dǎo)致錳中毒后的類似帕金森病的錐體外系功能異常。

線粒體融合/分裂平衡的改變尚未在PD中直接顯示。盡管對錳中毒的分子機(jī)制已有許久，但目前調(diào)控機(jī)制中仍有大片空白。正常情況下，損傷的線粒體由自噬體識別，分離后與溶酶體融合形成自體溶酶體，最終降解。本實(shí)驗(yàn)對SH－SY5Y細(xì)胞的線粒體自噬標(biāo)記蛋白LC3、線粒體分裂蛋白Drp1、線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2的表達(dá)水平進(jìn)行了研究。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3/Atg8）是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白。細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的LC3蛋白，LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ。細(xì)胞內(nèi)新合成的LC3其C端被Atg4蛋白酶剪切，成為胞質(zhì)可溶形式的LC3－Ⅰ。當(dāng)自噬體形成后，LC3－Ⅰ經(jīng)剪切和泛素化加工修飾，與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）偶聯(lián)，成為膜結(jié)合形式的LC3－Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜。與其他一些定位于自噬體膜上的Atg蛋白不同（僅在自噬過程的某一階段發(fā)揮作用），LC3－Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標(biāo)記分子［12］。LC3－Ⅱ的含量或 LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ的比例與自噬體的數(shù)量成正相關(guān)，在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性。而Mfn1和Mfn2共同介導(dǎo)線粒體的外膜融合［11］。線粒體分裂的關(guān)鍵蛋白Drp1，它控制著線粒體的外膜的分裂［13］。本研究的結(jié)果顯示，在細(xì)胞經(jīng)錳處理后，Drp1的表達(dá)降低，提示線粒體的分裂減少；Mfn1及Mfn2表達(dá)增加，提示線粒體的融合增多；LC3－Ⅱ的表達(dá)增加，提示細(xì)胞自噬增多，自噬活性上升。

綜上所述，在神經(jīng)細(xì)胞中，錳對線粒體具有特殊親和力，容易聚集在富含線粒體的神經(jīng)元中，錳中毒抑制了線粒體的分裂并促進(jìn)線粒體的融合，從而導(dǎo)致線粒體自噬的增多，這意味著錳積累的受損線粒體過度自噬導(dǎo)致線粒體功能紊亂也許是錳中毒性帕金森綜合征的病因之一，這可為錳中毒性帕金森綜合征提供新的治療靶點(diǎn)并對帕金森病的治療提供一定的幫助。