蔣兆梅，楊應(yīng)亮，胡必鳳，譚志冠，麥國鳳，阮 萍

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

慢性咽炎為咽部黏膜、黏膜下層及淋巴組織的彌漫性慢性炎癥，常為上呼吸道慢性炎癥的一部分。隨著生活環(huán)境的改變，慢性咽炎的患病率急劇增高［1］。治療慢性咽炎的方法很多，但傳統(tǒng)中藥見效慢，西醫(yī)主要采用抗菌藥物治療，可能造成咽部正常菌群失調(diào)，效果不太理想。植物精油是由植物的根、莖、葉、花或果實通過擠壓、蒸餾、萃取、析出等方式提煉出的一類重要次生物質(zhì)，也稱芳香油、揮發(fā)油，通常由數(shù)十種甚至數(shù)百種分子量小的簡單化合物組成，其成分復(fù)雜多樣［2－3］。研究表明，植物精油具有抑菌、抗氧化、殺蟲等生物活性，如薄荷、尤加利、云杉及乳香精油等在多種疾病中都有一定的治療作用［4－7］。Rantzsch等［8］發(fā)現(xiàn)，尤加利精油對慢性阻塞性肺疾病患者體內(nèi)提取的肺泡巨噬細胞具有一定的抗炎作用。本研究使用的檜木精油是從紅檜與扁柏中提取的，其主要成分是萜類化合物，具有抗炎癥、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等作用［9－10］。本文旨在探索檜木精油在治療慢性咽炎中的療效及其可能存在的機制，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物 SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量200～220 g，雄性，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（湘）2016－0002。

1.2 藥物與試劑 檜木精油（廣西檜元素生物科技有限公司，批號：161101）；慢嚴舒檸清喉利咽顆粒（山西桂龍醫(yī)藥有限公司，國藥準字Z20053117）；氨水（上?；瘜W(xué)試劑有限公司，許可證編號：XK 13－2010279012Ⅱ；規(guī)格：每瓶500 ml；濃度：25%～28%）；白細胞介素－1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子（TNF－α）試劑盒為上海藍基生物產(chǎn)品，批號分別為20151008、20150903。

1.3 儀器 喉頭噴霧器（江蘇平安醫(yī)療器械有限公司）；ST－360酶標儀（上海科華實驗系統(tǒng)有限公司）；T6紫外可見分光光度計（北京普利生有限公司）；高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有效公司產(chǎn)品）。

2 實驗方法

2.1 造模及分組［11］將48只SD雄性大鼠隨機分成空白組、模型組、檜木精油低劑量組（簡稱“檜低組”）、檜木精油中劑量組（簡稱“檜中組”）、檜木精油高劑量組（簡稱“檜高組”）、慢嚴舒檸清喉利咽顆粒組（簡稱“慢舒組”），共6組，每組8只。以苦味酸標記，并記錄每只大鼠的重量，各組大鼠均用普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。模型組、檜低組、檜中組、檜高組、慢舒組動物第1～15天上、下午各用2.5%氨水噴其咽部1次，每次用喉頭噴霧器噴3撳；空白組第1～15天同法予蒸餾水噴咽部。每日觀察大鼠的納食、活動量、飲水量、口腔分泌物及有無搔抓口咽部動作等，并每日觀察大鼠咽部1次。模型組于第16天腹主動脈取血5 ml，隨后處死，自大鼠環(huán)狀軟骨水平切斷氣管食管，取下咽部黏膜及其下組織以供作病理切片觀察。造模完成后，第16～25天參照李儀奎《中藥藥理實驗方法學(xué)》中的人與動物劑量換算方法［12］，慢舒組每天按9 g/kg劑量給藥，用時以55℃蒸餾水配置成濃度為0.1 g/ml的溶液進行噴咽；檜低組、檜中組、檜高組每天劑量按0.25 g/kg、0.5 g/kg、1 g/kg給藥，用時以 55℃蒸餾水配置成與慢舒組體積相等的溶液進行噴咽；空白組予同體積蒸餾水。

2.2 IL－1β及TNF－α含量測定 采用ELISA法檢測IL－1β、TNF－α。樣品處理：大鼠麻醉后腹主動脈取血5 ml左右置于抗凝采血管中，靜置15 min后置離心機中2 000 r/min，取血清于－20℃保存?zhèn)溆?。標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔，按順序編號，每連續(xù)2孔為一組，所加試劑、操作相同，稀釋、棄液后各孔加樣量都為50μl，TNF－α標準孔濃度分別為 240 ng/L，160 ng/L，80 ng/L，40 ng/L，20 ng/L；IL－1β 標準孔濃度分別為30 ng/L，20 ng/L，10 ng/L，5 ng/L，2.5 ng/L。加樣：待測樣品稀釋5倍反應(yīng)（待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40 μl，然后再加待測樣品 10 μl），封板混勻，37 ℃溫育30 min，濃縮洗滌液稀釋后重復(fù)洗滌5次，拍干。加酶：除空白孔，每孔加入酶標試劑50μl，溫育、洗滌同前。顯色：每孔先后加顯色劑A、B各50μl，搖勻，37℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)。測定：以空白孔調(diào)零，在15 min內(nèi)于450 nm波長處依序測量各孔的吸光度（OD值），依據(jù)標準品濃度與吸光度方程算出樣品中 IL－1β、TNF－α 的濃度。

2.3 病理形態(tài)學(xué)觀察 腹主動脈采血后，處死大鼠，暴露大鼠咽部并觀察，取大鼠咽部組織，于4%甲醛溶液中固定，以100%、95%、85%、75%、60%梯度乙醇逐步脫水，二甲苯透明組織，石蠟包埋，切片約4μm，HE染色，中性樹脂封片，并于光鏡下觀察各組大鼠咽組織病理變化，并進行分級評分［13］。評分標準共分5級：0分（－），正常結(jié)構(gòu)，黏膜、固有膜層無水腫，無炎癥細胞浸潤；1分（＋），黏膜上皮增生不明顯，固有層水腫，上皮下層輕度炎癥細胞浸潤；2分（＋＋），黏膜上皮輕度增生，上皮下層有炎癥細胞浸潤；3分（＋＋＋），黏膜上皮中度增生，上皮腳釘突形成并下延；4分（＋＋＋＋），黏膜上皮重度增生，腺上皮壞死，上皮下層有炎癥細胞浸潤。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析；病理形態(tài)學(xué)觀察的組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

本次研究共納入48只大鼠，造模15天后取模型組2只，用于病理切片觀察大鼠咽部組織是否有慢性炎癥改變，中途不明原因死亡6只。最后每組動物納入統(tǒng)計的數(shù)量：空白組8只、模型組6只、檜高組6只、檜中組7只、檜低組8只、慢舒組7只。

3.1 檜木精油對大鼠一般狀態(tài)的影響

3.1.1 納食方面 造模后至給藥前，造模組及給藥組納食均有減少，空白組無明顯變化。給藥后，給藥組納食有所增加。

3.1.2 活動情況 造模期間空白組活動量前后無明顯變化；造模的組別在造模前2天噴氨水后，活動量增多，稍亢奮。給藥期間，各組與造模期相比，除未出現(xiàn)亢奮外，活動量前后無明顯改變。

3.1.3 飲水頻率及24h飲水總量 空白組飲水頻率及飲水量前后無明顯改變，造模的組別噴氨水3天后飲水頻率及飲水總量均明顯增加，給藥后，各組飲水量持續(xù)增加。

3.1.4 口腔分泌物 造模期間，造模組口腔、鼻腔分泌物增多，并時常搔抓口部。給藥期間，各組口鼻分泌物有所減少。

3.1.5 咽部情況 造模3天后模型組咽部充血腫脹明顯、色澤鮮紅；15天后，咽部呈暗紅色，光澤欠佳，經(jīng)生理鹽水、檜木精油、慢嚴舒檸清喉利咽顆粒干預(yù)治療10d后，空白組咽部黏膜濕潤有光澤；模型組見咽部黏膜慢性充血，毛細血管擴張，分泌物增多，有些可見黏膜萎縮，干燥少津；慢舒組咽部紅腫減輕，分泌物較之前減少；檜低組和檜中組咽部仍有充血，但不如給藥前嚴重；檜高組咽部僅輕度紅腫，黏液少見。

3.2 檜木精油對慢性咽炎大鼠咽部組織病理形態(tài)學(xué)的影響 見圖1～圖6、表1。

正常組：咽部組織結(jié)構(gòu)清晰，復(fù)層鱗狀上皮光滑平整，固有層及黏膜下層未見水腫，僅可見散在淋巴細胞浸潤，腺泡小葉結(jié)構(gòu)完整（圖1）。

模型組：大鼠咽部組織分界不清，黏膜上皮角化過度、脫落，固有層和黏膜下層水腫，小血管增生并擴張充血，大量炎性細胞浸潤，腺小葉結(jié)構(gòu)局灶破壞，腺上皮壞死（圖2）。

慢舒組及檜低組：黏膜上皮欠光滑，上皮增生，黏膜下層有炎細胞浸潤（圖3、4）。

檜中組及檜高組：黏膜上皮角化過度，炎性滲出物較多，上皮增生，上皮腳下延并形成釘突，黏膜下腺體導(dǎo)管擴張，有黏液潴留，炎細胞聚集在黏膜及黏膜下層（圖 5、6）。

圖1 ～圖6 各組大鼠咽部組織形態(tài)圖 （×400）

表1 檜木精油對慢性咽炎大鼠咽部組織病理形態(tài)學(xué)的影響 （只）

表1顯示，與空白組比較，模型組動物咽部組織病理學(xué)分級加重（P＜0.05）；與模型組相比，檜木精油各劑量組及慢舒組的實驗動物咽部組織病理形態(tài)學(xué)分級均明顯減輕（P＜0.05）。

3.3 檜木精油對慢性咽炎大鼠血清中IL－1β、TNF－α的影響 見表2。

表2 檜木精油對慢性咽炎大鼠TNF－α、IL－1β的影響 （x±s）

表2顯示，與空白組比較，模型組TNF－α、IL－1β 水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，慢舒組TNF－α、IL－1β水平明顯降低，檜木精油各劑量組對 IL－1β 水平的降低有明顯作用（P＜0.05），檜木精油各劑量組能在一定程度上減少血清TNF－α的分泌，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

4 討論

慢性咽炎為咽部黏膜、黏膜下層組織的彌漫性慢性炎癥，常為上呼吸道慢性炎癥的一部分。主要由不良習(xí)慣、職業(yè)因素、生活環(huán)境、身體因素、遺傳因素和炎癥引發(fā)［14］。慢性咽炎作為耳鼻咽喉科的常見病，其發(fā)病占咽喉部疾病的10%～12%，多發(fā)生于成年人，城市發(fā)病率高，尤以教師、歌手居多［15］。且治療后極易反復(fù)發(fā)作，嚴重影響人們的正常生活?；颊哐什砍Ｓ挟愇锔?、癢感、灼熱感、干燥感或微痛感，常因周圍炎癥的刺激，咽壁黏膜充血肥厚，呈暗紅色，在咽后壁可見分散突起的小顆?；虺善绱闋?，其周圍有擴張的血管網(wǎng)，表面有時附有黏液或膿性分泌物。萎縮性咽炎與干燥性咽炎黏膜干燥，萎縮變薄，色蒼白發(fā)亮，常附有粘稠分泌物或帶臭味的黃褐色痂皮。

本研究采用低濃度氨水直接噴霧法長時間刺激大鼠咽部黏膜，建立慢性咽炎大鼠模型，模型動物病理損傷和血清細胞因子指標變化與臨床指標有一定的相似性，且操作方法簡單安全，是目前使用最廣泛的模型建立方法［11］。實驗表明，在造模2天后，造模動物出現(xiàn)口鼻分泌物增多，搔抓口部，咽部組織充血腫脹等體征，造模結(jié)束后組織切片結(jié)果顯示為咽部慢性炎癥病理改變，提示造模成功。

采用低濃度氨水反復(fù)刺激大鼠咽部，形成局部組織急性炎癥，血管通透性增高，釋放多種炎癥介質(zhì)，加重和激活新的炎癥反應(yīng)，造成局部組織變質(zhì)、滲出和壞死，病情容易遷延為慢性。實驗結(jié)果顯示：空白組咽部組織結(jié)構(gòu)清晰，復(fù)層鱗狀上皮光滑平整，固有層及黏膜下層未見水腫，僅可見散在淋巴細胞浸潤，腺泡小葉結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠咽部組織分界不清，黏膜上皮角化、脫落，固有層和黏膜下層水腫，小血管增生并擴張充血，大量炎性細胞浸潤，腺小葉結(jié)構(gòu)局灶破壞，腺上皮壞死，符合慢性炎癥改變。經(jīng)慢嚴舒檸清喉利咽顆粒和檜木精油干預(yù)后，局部炎癥均有一定程度改善，與模型組比較，動物咽部組織病理學(xué)分級顯著減輕，說明檜木精油對損傷的咽部黏膜組織具有修復(fù)作用。

在炎癥反應(yīng)過程中，細胞因子既是免疫系統(tǒng)的信息傳遞介質(zhì)，又是神經(jīng)、內(nèi)分泌及其他系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相互聯(lián)系的重要橋梁［16］。TNF－α是炎癥反應(yīng)的始動因子，由單核－巨噬細胞活化產(chǎn)生，可增高血管內(nèi)皮細胞的通透性，促進淋巴細胞活化，并誘導(dǎo)其他細胞因子及TNF－α自身的合成與釋放，共同促進炎癥反應(yīng)［17］。IL－1β是淋巴細胞刺激因子，主要由活化的單核－巨噬細胞產(chǎn)生，局部低濃度時主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，局部高濃度時產(chǎn)生內(nèi)分泌效應(yīng)。炎癥發(fā)生時，IL－1β主要介導(dǎo)趨化作用，參與白細胞的滲出和激活，加重炎癥反應(yīng)［18］。實驗結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組的TNF－α及IL－1β均明顯升高，提示這兩種炎癥介質(zhì)參與了慢性咽炎的發(fā)病進程。檜木精油各劑量組及慢舒組血清可能通過降低這兩種炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)，抑制炎癥進程。

綜上所述，檜木精油治療慢性咽炎的可能機制為：減少組織的變性和壞死，降低血管的通透性、減少炎癥細胞的組織浸潤，促進組織修復(fù)；降低血清TNF－α、IL－β等炎癥介質(zhì)水平，促進炎癥消除。本研究為檜木精油的抗炎作用提供了新思路，也為將來檜木精油在臨床應(yīng)用方面提供了理論基礎(chǔ)。往后我們將進一步探討檜木精油對炎癥介質(zhì)的作用機制，為其臨床應(yīng)用提供可靠的證據(jù)。