祁文磊 馮燕英 許 宙 陳茂龍 程云輝

(長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南 長沙 410114)

米渣是以早秈稻或碎米為原料發(fā)酵生產味精、淀粉糖、飴糖、麥芽糊精等工業(yè)生產過程中的副產物，其中蛋白質質量分數高達50%～70%[1]。近年來，中國南方部分地區(qū)如湖南、廣西、江西等地的大米鎘超標現象較為嚴重，這是因水稻植株根部吸收鎘離子后再經鎘結合轉運蛋白質運輸至籽粒并被蛋白質結合所致。楊居榮等[2]研究了水稻籽粒中鎘的結合形態(tài)，發(fā)現大米中8%的蛋白質富集了60%以上的鎘，因米渣中蛋白質含量高達50%～70%，進而造成鎘含量嚴重超標的現象；同時，因米渣蛋白質是熱變性蛋白質，溶解度也較低[3]。

目前常用的蛋白質改性方法主要包括物理法、化學法和酶法[4]，其中酶法改性因反應條件溫和、功能性質改善效果好、對環(huán)境污染小而普遍應用于食品行業(yè)。Zhao等[5]采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶和復合蛋白酶處理米渣蛋白質，研究了酶種類對米渣蛋白質功能性質的影響，結果表明酶解可使米渣蛋白質溶解度達到80%以上；崔沙沙等[6]采用堿性蛋白酶處理大米蛋白質，促使大米蛋白質內部親水基團暴露，大米蛋白質的溶解度從1.28%提高至94.65%。蒲利民等[7]采用枯草桿菌蛋白酶和胰蛋白酶混合水解馬氏珠母貝肉中的含鎘蛋白質，可使鎘從蛋白質等大分子中解離出來，解離度達到85.52%。

本試驗擬以高鎘含量米渣為原料，通過單因素試驗確定酶解時間、酶解溫度、底物濃度、pH、加酶量等因素的最佳水平值范圍，采用響應面中心組合試驗設計對相關因素進行綜合考察，優(yōu)化米渣蛋白質酶解的最佳工藝參數；同時研究酶解反應過程對米渣蛋白質中鎘含量的影響，以期為后續(xù)米渣蛋白質中鎘的脫除提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

米渣：湖南匯升生物科技有限公司；

堿性蛋白酶：Alcalase 2.4 L，酶活2.4 AU/mL，丹麥諾維信；

Folin-酚試劑：合肥博美生物有限公司；

牛血清白蛋白：美國Sigma公司；

氫氧化鈉、濃鹽酸、石油醚(60～90 ℃)：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

濃硝酸：優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

等離子發(fā)射光譜儀：5100VDV ICP-OES型，美國Agilent Technologies公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-551S型，金城實驗儀器廠；

數顯電動攪拌器：JJ-1型，常州國宇儀器制造有限公司；

離心機：TDL-36C型，上海安亭科學儀器廠；

紫外可見分光光度計：UV1800型，日本島津公司；

pH計：FiveEasyPlusTM型，美國Mettler Toledo公司；

冷凍干燥機：LGJ-18C型，北京四環(huán)科學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 米渣預處理及酶解工藝

(1) 米渣預處理工藝流程：米渣，粉碎，過篩(100目)，石油醚浸提，抽濾，浸提循環(huán)3次，脫脂米渣

(2) 酶解工藝流程：脫脂米渣，加水配制成不同底物濃度，室溫水化溶解0.5 h，水浴加熱至不同反應溫度，調節(jié)pH，加入不同酶量，酶解(pH-Stat法保持體系pH穩(wěn)定)，滅酶(15 min/90 ℃)，離心(15 min/3 500 r/min)，上清液，測定米渣蛋白質可溶性氮回收率

1.2.2 米渣酶解單因素試驗 以水解度和可溶性氮回收率為評價指標，以酶解溫度、pH、酶解時間、加酶量、底物濃度為影響因素，確定米渣酶解最佳條件。單因素試驗設計方案如下：

(1) 時間對米渣酶解反應的影響：配制底物濃度5%米渣酶解液，加熱溶液溫度60 ℃，1 mol/L NaOH調節(jié)pH至8.0，添加1%的Alcalase 2.4 L蛋白酶，pH-Stat法攪拌酶解1，2，3，4，5，6 h，90 ℃滅酶15 min，3 500 r/min離心15 min，記錄消耗NaOH體積并測定上清液蛋白含量。

(2) 加酶量對米渣酶解反應的影響：除分別添加0.5%，0.75%，1%，1.25%，1.5%的Alcalase 2.4 L蛋白酶外，其他條件與(1)相同。

(3) pH對米渣酶解反應的影響：除調節(jié)pH分別至6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0外，其他條件與(1)相同。

(4) 溫度對米渣酶解反應的影響：除加熱溫度分別為45，50，55，60，65 ℃外，其他條件與(1)相同。

(5) 底物濃度對米渣酶解反應的影響：因底物濃度>15%時，物料黏度的增大可能導致反應流動性、均勻性下降，本試驗選取米渣蛋白質濃度變化范圍為5%～15%。分別配制底物濃度5.0%，7.5%，10.0%，12.5%，15.0%米渣酶解液，其他條件與(1)相同。

1.2.3 響應面法優(yōu)化酶解工藝 在單因素研究基礎上，確定各因素的水平范圍，根據酶解的最佳條件，使用軟件Design Expert 8.0中Box Behnken模型進行優(yōu)化工藝設計。

1.2.4 水解度的測定 采用pH-Stat法，水解度按式(1)計算：

DH=B×Mb×1/α×1/Mp×1/htot，

(1)

式中：

B——NaOH的體積，mL；

Mb——NaOH的濃度，mol/L；

α——氨基酸的平均解離度，對于米渣蛋白質，1/α取1.01；

Mp——蛋白質的質量，g；

htot——每克原料蛋白質中肽鍵的毫摩爾數，米渣蛋白質取7.40 mmol/g。

1.2.5 可溶性氮回收率測定

(1) 上清液蛋白質含量測定：Folin-酚法[8]。

(2) 米渣中蛋白質含量測定：參照GB 5009.5—2016凱氏定氮法執(zhí)行。

(3) 可溶性氮回收率按式(2)計算：

(2)

1.2.6 鎘含量測定 采用等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)法[9]測定米渣、最佳酶解工藝條件下酶解上清液與沉淀中的鎘含量。

2 結果與討論

2.1 米渣蛋白質酶解工藝條件的研究

2.1.1 時間對米渣酶解反應的影響 由圖1可知，隨著酶解反應時間的延長，堿性蛋白酶與米渣充分接觸，米渣蛋白質可溶性氮回收率逐漸提高，4 h后米渣蛋白質可溶性氮回收率變化趨于平緩；在酶解反應的前3 h，隨著反應時間的延長水解度變化趨勢明顯，3 h后水解度增大趨勢變緩。說明隨著酶解時間的延長，酶解反應速率逐漸下降，為了保證酶解充分，確定酶解時間為4 h。

圖1 時間對米渣酶解反應的影響Figure 1 Effect of time on enzymatic hydrolysis of rice dregs

2.1.2 加酶量對米渣酶解反應的影響 如圖2所示，隨著加酶量的增加，米渣蛋白質可溶性氮回收率逐漸提高，但是提高幅度不大，當加酶量達到1%時，米渣蛋白質可溶性氮回收率趨于平緩；由于加酶量增加，酶與米渣蛋白質結合位點增多[10]，水解度逐漸增大。當酶與底物作用達到飽和，米渣蛋白質可溶性氮回收率趨于穩(wěn)定。綜合考慮生產成本，初步確定加酶量為1%。

圖2 加酶量對米渣酶解反應的影響Figure 2 Effect of enzyme amount on enzymatic hydrolysis of rice dregs

2.1.3 pH對米渣酶解反應的影響 由圖3可知，隨著pH由6.5增至8.0，米渣蛋白質可溶性氮回收率逐漸提高，當pH由 8.0增大至9.0時，米渣蛋白質可溶性氮回收率變化趨于穩(wěn)定；當pH為6.5～9.0，隨著pH增大，水解度增大趨勢一直較顯著。由于酶解過程采用pH-Stat法控制水解度，酶解過程引入的鹽分不僅影響最終產品的口味[11]，還可能會對米渣蛋白肽功能活性產生影響，綜合考慮經濟成本確定酶解pH為8.0。

圖3 pH對米渣酶解反應的影響Figure 3 Effect of pH on enzymatic hydrolysis

2.1.4 溫度對米渣酶解反應的影響 由圖4可知，溫度為60 ℃時，米渣蛋白質可溶性氮回收率達到最大值；低于60 ℃時，隨著溫度的提高，堿性蛋白酶的酶活性提高，酶與底物作用效果增強，米渣蛋白質可溶性氮回收率隨之提高；高于60 ℃時，堿性蛋白酶酶活性下降，米渣蛋白質可溶性氮回收率隨之降低，同時過高的溫度也使酶活性核心結構被破壞而變性[12]，部分或全部失去催化活性，因此確定酶解溫度為60 ℃。

圖4 溫度對米渣酶解反應的影響Figure 4 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis of rice dregs

2.1.5 底物濃度對米渣酶解反應的影響 由圖5可知，隨著米渣蛋白質濃度的增大，料液黏度的增大顯著影響了酶和底物的流動性，進而降低了酶與蛋白質的相互作用，米渣蛋白質可溶性氮回收率和水解度皆逐漸降低。綜合考慮工業(yè)化大規(guī)模生產的需求，確定底物濃度為10%。

2.2 米渣蛋白質酶解工藝響應面優(yōu)化

根據單因素試驗結果確定酶解時間4 h，以酶解pH、底物濃度、加酶量、酶解溫度為響應因素，可溶性氮回收率為響應值，設計四因素三水平響應面試驗，其因素水平編碼如表1所示。

圖5 底物濃度對米渣酶解反應的影響Figure 5 Effect of substrate concentration on enzymatic

表1 因素水平編碼表

米渣蛋白質酶解的響應面試驗設計及結果如表2所示。對表2的試驗結果，運用軟件Design-Expert 8.0進行變異分析，得到可溶性氮回收率(X)與反應溫度(A)、pH(B)、加酶量(C)和底物濃度(D)之間的二次多元回歸模型為：

X=-114.21+6.24A-2.17B-26.07C-4.22D+0.37AB+0.09AC-0.11AD+1.30BC+0.72BD+1.37CD-0.07A2-1.53B2+1.32C2+0.07D2。

(3)

試驗結果的方差分析如表3所示。由表3可知，失擬項P值為0.076 1>0.05不顯著，響應面模型的P<0.000 1極顯著，并且響應面模型的R2=0.984 5，表明模型具有較高的擬合度，試驗誤差較小。F值可以反映出各因素對試驗指標的影響程度[13]，據表3中各因素F值大小可知，酶解條件對可溶性氮回收率的影響順序為：D>B>C>A。一次項因素(B、C、D)對可溶性氮回收率影響極顯著，二次項(A2)和交互項(AB、AD、BD、CD)對可溶性氮回收率影響顯著。

響應面分析不僅可預測變量響應值，也可確定變量相互作用的關系，其響應曲面形狀可反映變量相互作用關系，等高線形狀可反映交互作用的強弱[14]。圖6是各因素影響酶解米渣蛋白質可溶性氮回收率的3D響應面圖和等高線圖，從圖6可知，底物濃度對可溶性氮回收率影響較大，隨著底物濃度的增大，可溶性氮回收率降低顯著；隨著pH的增大，可溶性氮的回收率逐漸提高，當pH由 8.0增大至9.0時，米渣蛋白質可溶性氮回收率變化趨于穩(wěn)定；底物濃度、pH和加酶量都對米渣蛋白酶解可溶性氮回收率的影響顯著。這也與表3的方差分析結果相符，底物濃度、pH、加酶量和溫度的F值分別為667.54，91.98，52.71，5.10，底物濃度對可溶性氮回收率的影響最大，溫度對可溶性氮回收率的影響相對最小。

表2 響應面設計方案及結果

綜上分析，通過輔助軟件Design-Expert 8.0對回歸方程擬合得到的最優(yōu)工藝條件為：溫度60 ℃、加酶量1.25%、pH 8.0、底物濃度7.5%，此時響應面預測最優(yōu)值為49.68%。根據最優(yōu)酶解工藝進行驗證實驗，3次平行試驗得到回收率為(49.21±0.12)%，在回歸模型推算的極值允許范圍內，說明該數學模型與實際相符，具有實際指導意義。

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗?

? *表示顯著(P<0.05)；**表示極顯著(P<0.01)；—表示不顯著(P>0.05)。

2.3 米渣蛋白質酶解對鎘含量的影響

酶解前脫脂米渣中鎘含量高達4.99 mg/kg，是GB 2762—2017《食品中污染物限量》規(guī)定稻谷類產品中鎘限量標準(0.2 mg/kg)的24倍以上。鎘是一種環(huán)境重金屬污染物，可通過農作物進入食物鏈，危害人體健康。水稻是一種易于富集鎘的糧食作物，研究[15]表明鎘在稻米中主要以配合物的形式存在，并與蛋白質呈配合物結構，而稻谷加工的副產物米渣中因蛋白質得到進一步富集而使得米渣中鎘含量嚴重超標。

為了解米渣蛋白質酶解對其鎘含量的影響，本試驗測定了最佳酶解工藝條件下酶解上清液與沉淀中的鎘含量，結果如圖7所示。從圖7可知，米渣蛋白質經堿性蛋白酶酶解后，不溶性的酶解沉淀(Enzymatic hydrolysis precipitation，EHP)中鎘含量達到7.71 mg/kg，相比米渣蛋白質增加了54.5%；酶解上清液(Enzymatic hydrolysis supernatant，EHS)凍干粉中鎘含量降低至1.43 mg/kg，相比米渣蛋白質降低了71.3%。米渣蛋白質酶解后，EHP、EHS中鎘含量的測定結果可為后續(xù)研究降鎘技術的選用提供依據。

圖7 米渣蛋白質酶解各組分鎘含量Figure 7 Cadmium content of each component in enzymatic hydrolysis of rice dregs

酶解上清液EHS中鎘含量的降低，不僅是因為堿性蛋白酶將大分子米渣蛋白質降解成小分子肽而使部分結合態(tài)鎘游離出來；同時，在米渣蛋白質中含量較高的巰基也被破壞，而巰基通常易與金屬離子發(fā)生配位反應[16]，巰基的破壞也使鎘從米渣蛋白質中解離出來，進入溶液中而成為游離態(tài)。此時，懸浮在溶液中的未被酶解的不溶性米渣蛋白質反而富集了更多的鎘，FENG等[17]發(fā)現在水溶液中米渣蛋白質對鎘的最大結合量可達12.08 mg/g，其研究結果還表明米渣蛋白質對鎘不僅是簡單的物理吸附，米渣蛋白質中巰基和羧基對鎘的結合具有重要作用[18]，因此，酶解過程中解離出的游離態(tài)鎘可能又再次與不溶性的米渣蛋白質結合，導致未被酶解的不溶性米渣蛋白質中鎘含量反而增高。

圖6 pH-溫度、溫度-底物濃度、加酶量-溫度、pH-底物濃度、加酶量-底物濃度、加酶量-pH交互影響響應面圖Figure 6 Response surface chart of reciprocal effect

3 結論

本試驗確定的酶解米渣蛋白質的最佳工藝條件為：溫度60 ℃、加酶量1.25%、pH 8.0、底物濃度7.5%，米渣蛋白質可溶性氮回收率為49.68%。米渣蛋白質經過堿性蛋白酶酶解后，酶解上清液凍干粉中鎘含量降低至1.43 mg/kg，相比米渣蛋白質降低了71.3%，驗證了蛋白酶不僅可將大分子米渣蛋白質降解成小分子肽，同時也能將鎘從米渣蛋白質大分子中解離出來[7]，但關于蛋白酶解離米渣蛋白質中鎘的相關機理，還需進一步深入研究。