翟世玉 ，殷 輝 ，周建波 ，唐秀麗 ，呂 紅 ，韓巨才 ，趙曉軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山西太原030031；3.農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

蘋果樹腐爛病在我國(guó)蘋果產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍[1]，是由黑腐皮殼屬病菌（Valsa spp.）引起的一種毀滅性真菌病害[2-4]。生產(chǎn)中通過(guò)提高蘋果樹體內(nèi)的鉀含量[5-6]、保持適宜的土壤水分條件[7]及利用生防菌劑[8]等來(lái)防治蘋果樹腐爛病。孫廣宇等[5]研究表明，蘋果樹葉片鉀含量與腐爛病的發(fā)病程度呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即腐爛病發(fā)生越嚴(yán)重的果樹，葉片內(nèi)含鉀量越低。季蘭等[9]研究表明，生產(chǎn)中施鉀較少是我國(guó)蘋果樹腐爛病發(fā)生嚴(yán)重的原因之一。王金友[10]研究提出，適當(dāng)增加蘋果樹皮中的鉀含量，能提高蘋果樹體的抗病能力，有效減輕病害的發(fā)生。然而，生產(chǎn)中只通過(guò)施用鉀肥防治腐爛病有其局限性，通常輔以其他措施來(lái)防治。

生物防治措施具有環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，符合現(xiàn)代社會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的要求且越來(lái)越受到人們的關(guān)注[11]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）作為黑腐皮菌（Valsa mali）的生防菌目前已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其對(duì)黑腐皮菌具有較好的抑制作用[12-14]。但是枯草芽孢桿菌在抑制黑腐皮菌的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)退化現(xiàn)象，隨著時(shí)間推移抑菌率降低[15]。

為提高生防菌的穩(wěn)定性，國(guó)內(nèi)外研究者將生防菌與化學(xué)藥劑[16-17]聯(lián)用后發(fā)現(xiàn)有協(xié)同增效的作用。如馬志強(qiáng)等[18]將哈茨木霉菌與啶酰菌胺聯(lián)用后對(duì)番茄灰霉病菌表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。畢秋艷等[19]研究表明，枯草芽孢桿菌與氟環(huán)唑聯(lián)用對(duì)禾谷鐮孢霉表現(xiàn)出持效和增效作用。姚克兵等[20]提出將枯草芽孢桿菌制劑BCA與吡唑醚菌酯（PS）聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)可以提高生防菌的存活率，同時(shí)增加對(duì)病害的防治效果。谷春艷等[21]將解淀粉芽孢桿菌與咪鮮胺聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)其對(duì)草莓炭疽病的防治效果極顯著高于施用2個(gè)單劑。除生防菌劑和化學(xué)藥劑聯(lián)用表現(xiàn)協(xié)同作用外[22-23]，胡清玉等[24]以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為主要菌群和肥料聯(lián)用，通過(guò)根施該菌肥能顯著降低腐爛病的發(fā)生。

菌肥聯(lián)用在生產(chǎn)上有一定防效[25-26]，但生防菌和肥聯(lián)用后對(duì)生防菌的影響及其抑菌率等的研究尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究擬將對(duì)黑腐皮病菌有較好抑制作用的枯草芽孢桿菌和鉀聯(lián)用，探索枯草芽孢桿菌和鉀聯(lián)用后對(duì)黑腐皮菌的抑菌效果，以期提高枯草芽孢桿菌的抑菌率和保持其抑菌的穩(wěn)定性，為使用菌肥防治蘋果樹腐爛病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株：病原菌為蘋果黑腐皮菌（Valsa mali），YC90；生防菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），LF17。菌株于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害研究室保存[27]。

試劑：99.5%磷酸二氫鉀（KH2PO4）原藥（天津市博迪化工有限公司）；99.5%氯化鉀（KCl）原藥（天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠）；99.0%硫酸鉀（K2SO4）原藥（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[28]；NB培養(yǎng)基[29]。

儀器：WFZUV-2800H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液母液的制備 將枯草芽孢桿菌菌株LF17在PDA上活化后，用打孔器取2個(gè)菌餅，接種至100 mL NB液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min搖培72 h后得到枯草芽孢桿菌種子液。將種子液按1%（5.6×109cfu/mL）的接種量接入100 mL NB培養(yǎng)基中，于28℃，180 r/min搖培72 h制成發(fā)酵液母液于4℃保存?zhèn)溆肹30-31]。

1.2.2 枯草芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定 配制系列質(zhì)量濃度為 300，150，100，20，1 mg/mL 的 KH2PO4及KCl母液，系列質(zhì)量濃度為100，20，1 mg/mL的K2SO4母液，4℃保存?zhèn)溆?。將上述母液與NB培養(yǎng)基按體積比1∶10充分混勻后制成含鉀的NB培養(yǎng)基，滅菌待用。每毫升含鉀的NB培養(yǎng)基接種0.01mL發(fā)酵液母液，28℃，180 r/min的條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液OD600值，每個(gè)處理重復(fù)3次，以含鉀質(zhì)量濃度0 mg/mL的發(fā)酵液為對(duì)照。以未接菌含不同濃度鉀的NB培養(yǎng)基為背景，采用比濁法[32]測(cè)定OD600值，并計(jì)算枯草芽孢桿菌活菌數(shù)，計(jì)算公式[27]如下。

1.2.3 枯草芽胞桿菌和鉀的協(xié)同作用測(cè)定 參考畢秋艷等[19]采用的固體平板擴(kuò)散法-打孔法測(cè)定抑菌活性，測(cè)定不同濃度含鉀發(fā)酵液對(duì)黑腐皮菌的影響。在PDA平板中心畫2條十字交叉線，每條線等分3份，等分點(diǎn)處用打孔器打4個(gè)直徑為5 mm的孔，分別注入30 μL含不同濃度KH2PO4，KCl的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液后，在平板中心接種5 mm黑腐皮菌菌餅，將培養(yǎng)皿正面朝上，于28℃恒溫放置3 h后倒置培養(yǎng)，發(fā)酵液和含不同濃度KH2PO4，KCl的含鉀發(fā)酵液為處理，以只接黑腐皮菌為對(duì)照，3次重復(fù)。分別于3，5，10 d后測(cè)定黑腐皮菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，公式如下。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003，SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，其中，用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析；用Excel 2003和HemI對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度 KH2PO4，KCl，K2SO4對(duì)枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響

枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中加入不同質(zhì)量濃度KH2PO4，隨著質(zhì)量濃度增加活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，與活菌數(shù)為5.6×109cfu/mL的對(duì)照相比，增幅范圍為 2.2×108～1.5×109cfu/mL，KH2PO4質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，活菌數(shù)最多，達(dá)7.1×109cfu/mL；發(fā)酵液中加入不同質(zhì)量濃度KCl，活菌數(shù)呈緩慢上升趨勢(shì)，增幅范圍為 9.0×107～1.4×108cfu/mL，KCl質(zhì)量濃度為30 mg/mL時(shí)，活菌數(shù)最多，達(dá)5.74×109cfu/mL；發(fā)酵液中加入不同質(zhì)量濃度K2SO4，質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)相比對(duì)照活菌數(shù)增加了2.7×108cfu/mL，其他質(zhì)量濃度相比對(duì)照活菌數(shù)呈降低趨勢(shì)，K2SO4質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，活菌數(shù)量最少，比對(duì)照降低了 1.72×109cfu/mL（圖 1）。

2.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵液與KH2PO4聯(lián)用對(duì)黑腐皮菌的抑菌效果

發(fā)酵液中KH2PO4質(zhì)量濃度增加，對(duì)黑腐皮菌的抑菌率升高。各個(gè)處理的抑菌率有差異，其中，10，15 mg/mLKH2PO4發(fā)酵液抑菌效果最佳。隨著時(shí)間的推移，各個(gè)處理的抑菌率明顯提高，10 d時(shí)達(dá)到最佳抑菌效果且趨于穩(wěn)定（圖2）。

結(jié)果顯示，培養(yǎng)3d，當(dāng)KH2PO4質(zhì)量濃度為15mg/mL時(shí)，抑菌率最高，達(dá)80.22%，高于對(duì)照（58.27%），增幅為5.47～19.78百分點(diǎn)，與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05）；培養(yǎng)5 d時(shí)，KH2PO4質(zhì)量濃度為10 mg/mL的抑菌率最高，達(dá)到91.11%，高于對(duì)照（88.16%），但差異不顯著；培養(yǎng)10 d時(shí)抑菌率值達(dá)到最高，其中，KH2PO4質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)抑菌率最高，達(dá)到96.33%，各處理與對(duì)照相比增幅為2.22～4.11百分點(diǎn)，差異顯著（P＜0.05）。抑菌率總趨勢(shì)隨時(shí)間的推移而提高（圖3）。

2.3 枯草芽孢桿菌與KCl聯(lián)用對(duì)黑腐皮菌的抑菌效果

隨著發(fā)酵液中KCl質(zhì)量濃度升高，含鉀發(fā)酵液的抑菌值隨KCl質(zhì)量濃度增加逐漸增大，后又呈下降趨勢(shì)，其中，2 mg/mL質(zhì)量濃度的抑菌效果最佳。隨時(shí)間的推移，對(duì)黑腐皮菌的抑菌率趨于穩(wěn)定，當(dāng)KCl質(zhì)量濃度為2 mg/mL，培養(yǎng)10 d時(shí)的抑菌效果最好（圖 4）。

結(jié)果顯示，培養(yǎng)3 d時(shí)KCl質(zhì)量濃度為2 mg/mL的發(fā)酵液抑菌率最高，達(dá)92.48%，比對(duì)照增加7.77百分點(diǎn)，與各處理相比差異顯著（P＜0.05）；培養(yǎng)5 d，KCl質(zhì)量濃度為2 mg/mL的發(fā)酵液抑菌率最高，達(dá)93.33%，高于對(duì)照（89.72%），與各處理相比差異顯著（P＜0.05），且其余各質(zhì)量濃度抑菌率均低于對(duì)照；10d時(shí)的抑菌率最高，當(dāng)KCl質(zhì)量濃度為2mg/mL時(shí)抑菌率最高，達(dá)到95.56%，高于對(duì)照（90.96%），與各處理相比差異顯著（P＜0.05）。隨時(shí)間的推移，對(duì)黑腐皮菌的抑菌率提高，發(fā)酵液中KCl質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)的抑菌率最好（圖5）。

3 結(jié)論與討論

枯草芽孢桿菌主要通過(guò)拮抗物質(zhì)、誘導(dǎo)植物抗性、競(jìng)爭(zhēng)作用和溶菌作用等機(jī)制同時(shí)或分別作用達(dá)到對(duì)病原菌的抑制作用[33-34]。如何使枯草芽孢桿菌抑菌率提高、抑菌效果穩(wěn)定是研究的重點(diǎn)[35]。KH2PO4和KCl與枯草芽孢桿菌聯(lián)用直接或間接影響枯草芽孢桿菌的生防功能[36]。本研究在枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中加入不同鉀肥，發(fā)現(xiàn)含KH2PO4的發(fā)酵液中活菌數(shù)明顯增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，活菌數(shù)最多。相比對(duì)照，含KH2PO4的發(fā)酵液對(duì)黑腐皮菌的抑菌效果表現(xiàn)為穩(wěn)定、抑菌率提高。其中，培養(yǎng)10 d時(shí)，含不同KH2PO4質(zhì)量濃度的發(fā)酵液的抑菌率達(dá)到最高且趨于穩(wěn)定，各處理差異不顯著。因此，混用二者時(shí)KH2PO4的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL即可起到增效作用。在發(fā)酵液中加入KCl后對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)影響較小。當(dāng)發(fā)酵液中KCl的質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)抑菌效果最佳。

本研究中含KH2PO4的發(fā)酵液中的活菌數(shù)明顯增加，提高了枯草芽孢桿菌離體競(jìng)爭(zhēng)的能力，進(jìn)而表現(xiàn)為增效作用。KCl沒(méi)有顯著提高發(fā)酵液中的活菌數(shù)，但是提高了發(fā)酵液抑菌的穩(wěn)定性，可能其對(duì)枯草芽孢桿菌拮抗物質(zhì)有影響，其增效機(jī)制還需深入研究。此外，由于K2SO4在發(fā)酵液中的溶解性較低，試驗(yàn)僅設(shè)置了3個(gè)質(zhì)量濃度梯度，有一定局限性；結(jié)果表明，發(fā)酵液中加入K2SO4活菌數(shù)呈顯著減少趨勢(shì)，尚無(wú)法明確K2SO4和枯草芽孢桿菌之間的相互關(guān)系，還需進(jìn)一步研究。

通過(guò)研究枯草芽孢桿菌和鉀聯(lián)合作用機(jī)制，可以使二者達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，發(fā)揮多位點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，從而達(dá)到增強(qiáng)抑菌和防病效果[37-38]。胡清玉等[24]研究發(fā)現(xiàn)，以枯草芽孢桿菌為主要菌群和鉀肥聯(lián)用可增強(qiáng)蘋果樹的樹勢(shì)，顯著降低腐爛病病疤復(fù)發(fā)率；推測(cè)協(xié)同增效機(jī)制是鉀肥能夠提高枯草芽孢桿菌的競(jìng)爭(zhēng)力和樹體組織抗腐爛病菌擴(kuò)展能力，從而增強(qiáng)了防治效果。然而，不同類型的鉀肥與枯草芽孢桿菌聯(lián)用后對(duì)黑腐皮菌的抑菌效果直接影響著枯草芽孢桿菌的生防潛力[39]。本研究結(jié)果表明，KH2PO4和枯草芽孢桿菌的協(xié)同增效作用、兼容性最好，KCl提高了發(fā)酵液抑菌的穩(wěn)定性。本試驗(yàn)測(cè)定鉀和枯草芽孢桿菌聯(lián)用對(duì)黑腐皮菌的抑菌效果，針對(duì)鉀和枯草芽孢桿菌聯(lián)用后拮抗物質(zhì)、植物抗病性及寄主體內(nèi)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)能力等問(wèn)題，現(xiàn)階段還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道，結(jié)論尚無(wú)法明確，還需下一步進(jìn)行深入研究。