孫振高，王曉明，王天琪，楊毅，徐凱月

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東 濟南 250014）

自然流產(chǎn)是指妊娠＜28周，胎兒體重＜1 000 g而終止者[1]，屬婦科常見病、多發(fā)病，其發(fā)生率高達10%～15%。近年來，隨著二胎政策出臺，高齡孕婦所占比例升高，導(dǎo)致自然流產(chǎn)發(fā)生率呈逐年上升趨勢。自然流產(chǎn)病因復(fù)雜多樣，除已知病因外，臨床上仍有40%～50%原因不明[2]，因此探索自然流產(chǎn)未知病因具有緊迫性和挑戰(zhàn)性。卵泡液（follicular fluid,FF）是卵母細胞生長發(fā)育所需要的微環(huán)境，研究FF代謝物成分可以間接反映卵母細胞質(zhì)量及發(fā)育潛能。本研究旨在通過FF代謝組學(xué)篩選具有診斷價值的FF代謝標(biāo)志物，為解釋不明原因自然流產(chǎn)發(fā)生機制提供科學(xué)依據(jù)，為自然流產(chǎn)夫婦的生育問題作出貢獻。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 一般資料收集2016年5月—2017年12月就診于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心因輸卵管因素行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET）患 者 的FF。分為流產(chǎn)組（IVF-ET后自然流產(chǎn)者）40例和對照組（IVF-ET后分娩者）45例。該研究已獲得本院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會審議批準(zhǔn)，所有對象簽署知情同意書。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)主要參照全國統(tǒng)編8年制教材沈鏗、馬丁主編的第3版《婦產(chǎn)科學(xué)》[1]。

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)①因輸卵管因素行試管嬰兒者；②符合自然流產(chǎn)西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；③年齡24～40歲的非妊娠期及哺乳期婦女；④肝、腎功能正常，無婦科及其他全身疾病；⑤知情同意，志愿受試者。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)①合并有心腦血管、肝、腎及造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者，精神病患者；②近半年內(nèi)接受過激素類藥物治療；③對本研究使用藥物過敏；④不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，未按規(guī)定用藥，無法判斷療效或資料不全等影響療效及安全性判斷；⑤因內(nèi)分泌異常、免疫功能異常、子宮及內(nèi)膜因素、創(chuàng)傷刺激、不良生活習(xí)慣及藥物因素、胚胎和/或夫婦染色體異常、男方精液異常、環(huán)境因素等導(dǎo)致流產(chǎn)；⑥體重指數(shù)（body mass index,BMI）≥24 kg/m2。

1.2 臨床研究步驟

采用促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropinreleasing hormone-a,GnRH-a）黃體期長方案，促排卵前1周期監(jiān)測卵泡發(fā)育，于排卵后7 d（黃體中期）或孕酮（Progesterone,P）＞5 ng/ml，開始注射短效GnRH-a（法國益普生公司）達到垂體降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)（卵泡直徑≤0.5 cm，血FSH、LH＜5 IU/L，E2＜50 pg/ml），約降調(diào)14～17 d即開始使用促性腺激素（Gonadotropin,Gn）啟動超促排卵，根據(jù)患者體重及卵巢反應(yīng)性確定Gn啟動劑量，監(jiān)測B超及血激素觀察卵泡發(fā)育情況，適時調(diào)整藥量，當(dāng)≥2個卵泡的直徑≥18 mm，肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）10 000 IU（珠海市麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司）。注射HCG后36 h進行B超引導(dǎo)下穿刺取卵，收集第1管淡黃色、透明、無血FF，顯微鏡下確認有MⅡ期卵母細胞存在，收集的FF 3 000 r/min離心15 min；將上清液分裝于離心管（Eppendorf,EP）（海門市鉦博實驗器材廠）中，標(biāo)記后直接凍存于液氮貯存罐中，8周內(nèi)實驗備用。

1.3 實驗研究步驟

1.3.1 樣品制備精密稱取200μl受試者FF至玻璃試管，加入600μl甲醇（美國默克公司）∶乙腈（美國默克公司）∶水（4∶4∶2），渦旋1 min，14 000 r/min離心30 min，吸取上清液至EP管內(nèi)，取5μl進樣分析。

1.3.2 實驗條件本實驗分別采用Kinetex C18，2.1 mm×100.0 mm，2.6μm和Waters BEH Amide，100.0 mm×2.1 mm，1.7μm 2種色譜柱采集。Kinetex C18：流動相A為水相0.02%甲酸（上海斯信生物科技有限公司）；流動相B為有機相乙腈。Waters BEH Amide：流動相A為水相10 mmol甲酸胺（上海斯信生物科技有限公司）；流動相B為有機相乙腈∶水為95∶5（V/V），含10 mmol甲酸胺。2種色譜柱流速均為0.4 ml/min，柱溫為40℃。質(zhì)譜采用AB SCIEX Triple TOF 5600+，在正負離子模式下對數(shù)據(jù)進行采集。掃描方式為經(jīng)典的數(shù)據(jù)依賴性掃描（IDA），1次一級質(zhì)譜掃描（100 ms）觸發(fā)10次二級質(zhì)譜掃描（50 ms）。動態(tài)背景扣除（DBS）功能開啟。一級掃描范圍100～1 000 m/z，二級掃描范圍100～1 000 m/z，氣簾氣35 psi，霧化氣55 psi，輔助霧化氣55 psi，離子源溫度550℃，去簇電壓100 V，碰撞電壓（35±15）V。

1.3.3 代謝組學(xué)分析利用代謝組學(xué)方法對獲取的多維色譜數(shù)據(jù)進行分析，并將其轉(zhuǎn)化為一個矩陣，采用主成分分析法（PCA）和偏最小二乘法-判別分析法（PLS-DA）從整體上對樣本進行直觀、可靠和有統(tǒng)計學(xué)意義的分析。在得分圖中每個點代表1個對應(yīng)的樣本，載荷圖中離散點代表得分圖分離的變量，離散度越高，對得分圖貢獻越大。通過t檢驗對每個變量進行計算求出P值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由此得到組間有差異性的物質(zhì)質(zhì)荷比，由獲得的精確質(zhì)量數(shù)與同位素豐度比得到匹配的分子式，根據(jù)一級和二級質(zhì)譜信息鑒定這些差異物，并通過數(shù)據(jù)庫搜索得到相關(guān)的代謝通路。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用兩獨立樣本校正的t檢驗；計數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

流產(chǎn)組與對照組患者年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)促卵泡激素（basal follicle-stimulating hormone,bFSH）、基礎(chǔ)促黃體生成素（basal luteinizing hormone,bLH）、基礎(chǔ)雌二醇（basal estradiol,bE2）、基礎(chǔ)竇卵泡 數(shù)（basal antral follicle count,AFC）、Gn天 數(shù)、Gn用量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在臨床評價指標(biāo)方面，兩組患者受精率、優(yōu)胚率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），流產(chǎn)組低于對照組，流產(chǎn)組卵母細胞質(zhì)量和胚胎質(zhì)量較差，說明FF代謝物水平的變化可能對卵母細胞和胚胎質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響；而兩組患者獲卵數(shù)、2PN卵裂率、凍胚移植（frozen embryo transfer,FET）及鮮胚移植（embryo transfer,ET）所占比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、2。

2.2 兩組樣品總離子流圖

采用超高液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國SCIEX公司）分別在正離子和負離子模式下對流產(chǎn)組和對照組FF樣品進行采集，兩組樣品的總離子流圖見圖1、2，圖中峰值越高說明化合物的響應(yīng)值 越高。

表1 兩組患者一般資料比較（±s）

表1 兩組患者一般資料比較（±s）

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表2 對照組與流產(chǎn)組體外受精結(jié)局比較 %

2.3 兩組樣品PCA得分

利用非靶向代謝組學(xué)手段對自然流產(chǎn)患者FF樣品進行全面分析，經(jīng)過峰提取、峰匹配及統(tǒng)計分析，兩組樣品分析的PCA得分圖見圖3、4，圖中點分布越密集表示差異越小，分布越分散表示差異越大。兩組在PC1維度上得到良好地分離，說明流產(chǎn)組FF內(nèi)物質(zhì)與對照組相比差異顯著，自然流產(chǎn)患者FF內(nèi)物質(zhì)發(fā)生了變化。

圖1 在正離子模式下兩組FF樣品的色譜總離子流圖

圖3 正離子模式下兩組FF化合物的得分圖

2.4 組間差異代謝物種類

圖4 負離子模式下兩組FF化合物的得分圖

通過XCMS代謝組學(xué)軟件熱圖分析及t檢驗找到有差異的化合物，并鏈接到Metlin數(shù)據(jù)庫，根據(jù)一級和二級質(zhì)譜信息，鑒定差異物，并把這些差異物通過KEGG聚類分析，指向差異通路。經(jīng)鑒定共32種差異化合物，包括膽固醇類、維生素類、氨基酸類、脂肪酸類、膽酸類、溶血卵磷脂類及其他7大類，其中流產(chǎn)組FF中表達上調(diào)的有Dehydroepiandrosterone sulfate，LysoPC（16∶0），LysoPC（18∶1），LysoPC（18∶2），LysoPC（18∶3），LysoPC（20∶3），LysoPC（20∶4），Palmitoylglycerophosphocholine等8種化合物，表達下調(diào)的有L-valine，6-Oxohexanoate，L-Phenylalanine，2-Oxoglutarate，Linoleate，Oleic acid，Oleic acid，Docosahexaenoic acid，13，14-Dihydroretinol，Lithocholic acid，stearoylcarnitine，25-Hydroxyvitamin D3，Hydroxycholesterol，Chenodeoxyglycocholate，Trihydroxy-5beta-cholestan-26-al，13'-hydroxy-alpha-tocopherol，13'-hydroxyalpha-tocopherol，Tryptophan，LysoPC（18∶0），LysoPC（20∶5），Bilirubin等24種。見表3。

表3 流產(chǎn)組與對照組組間差異化合物

3 討論

自然流產(chǎn)病因復(fù)雜多樣，目前除感染因素、免疫因素、染色體異常等因素外，仍有40%～50%原因不明[2]。自然流產(chǎn)的發(fā)生大多歸于母體和胚胎2方面因素，除常見因素外，母體因素還應(yīng)包括卵母細胞質(zhì)量，胚胎因素即指胚胎質(zhì)量，而胚胎質(zhì)量與卵母細胞質(zhì)量直接相關(guān)。卵母細胞基因組而不是父系來源的基因組，是控制早期胚胎發(fā)育的關(guān)鍵，卵母細胞質(zhì)量已成為影響妊娠結(jié)局的重要因素，而FF代謝物成分間接反映卵母細胞質(zhì)量及發(fā)育潛能。本研究運用非靶向代謝組學(xué)的研究思路對流產(chǎn)組與對照組患者FF進行分析，找到有差異的化合物，這些差異物質(zhì)包括膽固醇類、維生素類、氨基酸類等，現(xiàn)就其與自然流產(chǎn)相關(guān)性進行歸類探討。

3.1 膽固醇類

膽固醇是細胞膜的基本結(jié)構(gòu)成分，在胎兒每個發(fā)育階段，膽固醇的調(diào)節(jié)平衡至關(guān)重要。27-羥基膽固醇是膽固醇合成的有效抑制劑，在早孕期調(diào)節(jié)膽固醇代謝中起重要作用，如果孕早期其平衡紊亂，不能調(diào)節(jié)膽固醇代謝，則會影響滋養(yǎng)層細胞浸潤和胎盤功能，引起流產(chǎn)[3]。LARKIN等[4]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)25-羥基膽固醇的濃度與hCG和P水平有關(guān)，其濃 度＞30μmol/L時，會導(dǎo)致hCG、P水平降低，影響妊娠結(jié)局，引起流產(chǎn)。

3.2 維生素類

免疫因素是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion,RSA）的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期母胎界面合成的25-羥維生素D3可作為免疫調(diào)節(jié)細胞因子來預(yù)防母體的排斥反應(yīng)，從而降低流產(chǎn)風(fēng)險[5]。Treg/Th17細胞的平衡是持續(xù)妊娠的重要因素，研究發(fā)現(xiàn)維生素D可在Treg與Th17細胞的平衡中發(fā)揮作用，從而降低RSA的風(fēng)險[6]。α-生育酚（alpha-tocopherol,α-TE）是一種脂溶性抗氧化劑，是胚胎發(fā)育所必需。?IM?EK等[7]研究發(fā)現(xiàn)α-TE能清除過氧自由基，減少氧化應(yīng)激，降低流產(chǎn)的發(fā)生率。MILLER等[8]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，α-TE缺乏的斑馬魚可以產(chǎn)生活卵，但后期胚胎遭受發(fā)育障礙并死亡，因此α-TE缺乏可能與胚胎停育相關(guān)。此外，α-TE還可能通過其有效的抗氧化活性，減弱砷的致畸作用，從而降低砷暴露胎兒的死亡率，減少流產(chǎn)的發(fā)生率[9]。

3.3 氨基酸類

氨基酸對胚胎生長發(fā)育至關(guān)重要。吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）是降解色氨酸的細胞質(zhì)酶。ZONG等[10]研究發(fā)現(xiàn)，IDO的缺乏與RSA相關(guān)，其機制可能為IDO抑制局部T細胞增殖，防止因免疫反應(yīng)而引起的胎盤對胚胎排斥[11]，這也間接反映色氨酸對妊娠維持的重要性。FEI等[12]認為，色氨酸代謝是稽留流產(chǎn)的重要潛在靶標(biāo)途徑。ZHANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)，支鏈氨基酸（branched-chain amino acid,BCAA）與妊娠結(jié)局密切相關(guān)，在BCAA截斷值為239.10μmol/L時，BCAA水平升高的受試者流產(chǎn)率升高。BANERJEE等[14]對特發(fā)性反復(fù)自然流產(chǎn)（Idiopathic recurrent spontaneous miscarriage,IRSM）患者進行血清代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，賴氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸等在IRSM中顯著升高。亮氨酸也是與胚胎發(fā)育密切相關(guān)的一種氨基酸，POGORELOVA等[15]發(fā)現(xiàn)，胎兒生長受限患者胎盤亮氨酸含量降低，亮氨酸水平低下影響胚胎生長發(fā)育，造成胚胎生長遲緩或死胎。

3.4 脂肪酸類

脂肪酸通常分為飽和脂肪酸（saturated fatty acid,SFA）、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid,MUFA）及多不飽和脂肪酸，在卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育中起重要作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)期間，加入低生理濃度（1μmol/L）的二十二碳六烯酸能夠改善體外卵母細胞質(zhì)量，并可提高囊胚率[16]。此外，更高的MUFA攝入量可提高胚胎移植后活產(chǎn)率[17]。同時動物模型研究發(fā)現(xiàn)，SFA與受精、卵裂和囊胚形成率降低有關(guān)，而油酸可以減少其負面影響[18]。COLVIN等[19]則發(fā)現(xiàn)棕櫚酸酯可增加合體滋養(yǎng)細胞死亡率，從而影響胚胎發(fā)育，造成流產(chǎn)。

3.5 溶血卵磷脂類

LI[20]、CHEN等[21]通過代謝組學(xué)方法研究砷、鎘暴露孕婦的尿代謝變化，發(fā)現(xiàn)LysoPC是砷、鎘代謝相關(guān)生物標(biāo)志物。目前大量研究證實，砷、鎘等重金屬與胚胎停育的發(fā)生密切相關(guān)，這也間接反映LysoPC與自然流產(chǎn)的相關(guān)性[20-21]。

本研究運用FF代謝組學(xué)的研究方法，探討自然流產(chǎn)患者與分娩者的FF差異代謝物，這些差異代謝物可能成為診斷自然流產(chǎn)的生物標(biāo)志物，為自然流產(chǎn)的診斷、治療及新藥研發(fā)提供新方法和新思路。然而，本研究樣本量較少，尚不能代表大部分自然流產(chǎn)患者FF水平，還需擴大樣本量，以做更深一步的研究。此外，考慮到多次經(jīng)陰道穿刺取卵會增加陰道流血的風(fēng)險，因此研究中收集的是患者所有FF的總和，可能會對研究結(jié)果產(chǎn)生一定影響，因此尚需探索新方法，以求研究結(jié)果更加客觀、準(zhǔn)確。