郭志鵬,馮長松,張靖雪,王苗利,曲根,劉建宇,管永卓,張曉婷,郭玉霞*,嚴學兵
(1.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002;2.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧所,河南 鄭州 450002;3.揚州大學動物科學與技術學院,江蘇 揚州 225000)
紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培最早、種植面積最大、利用價值最高的一種多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草[1],有“牧草之王”的美譽[2]。其在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中有著不可替代的作用[3]。我國是畜牧大國,對苜蓿草的需求很大,2015年我國的苜蓿商品干草產(chǎn)量為123萬t,進口苜蓿為121萬t[4]。農(nóng)業(yè)部發(fā)布的苜蓿產(chǎn)業(yè)“十三五”規(guī)劃提出,到2020年,全國優(yōu)質(zhì)苜蓿產(chǎn)量將達到540萬t[5]。隨著我國苜蓿種植面積的不斷增加以及種植年限的延長,苜蓿病毒病害的發(fā)生越來越嚴重,已成為限制苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因之一[6]。目前國內(nèi)對苜蓿病毒病的研究甚少,韓玉靜等[7]、張麗[8]、王瑜等[9]、張蓉等[10]、楊雨翠[11]和張芯偽[12]僅僅調(diào)查了苜?;ㄈ~病的田間發(fā)病率。周其宇等[6]通過病原檢測對侵染苜蓿的苜蓿花葉病毒、白三葉(Trifoliumrepens)花葉病毒、菜豆(Phaseolusvulgaris)黃花葉病毒和豇豆(Vignaunguiculata)花葉病毒進行了鑒定,并測定了這4種病毒的寄主范圍。南志標[13]研究了苜?;ㄈ~病對苜蓿田間產(chǎn)量和質(zhì)量的影響。國外的研究發(fā)現(xiàn)侵染苜蓿的病毒至少有31種[14-20]。
以往在苜蓿病毒病的研究中,多是在病毒種類的鑒定上進行試驗,有關苜蓿不同品種對病毒病的抗性研究尚未見報道。目前,國內(nèi)栽培的苜蓿品種繁多,不同地區(qū)不同品種的抗性表現(xiàn)不同,在引種苜蓿時,評價不同品種苜蓿對病毒病的抗性是很有必要的,以篩選適應本地種植的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的苜蓿品種。本研究利用小RNA深度測序技術結(jié)合RT-PCR技術檢測鑒定30個紫花苜蓿品種中的病毒種類,并測定各紫花苜蓿品種的發(fā)病率、病情指數(shù)、相對株高、相對單株干重、相對莖稈直徑、相對葉面積、相對葉長和相對葉寬,比較各紫花苜蓿品種的抗性表現(xiàn),篩選出抗性較強的品種,同時測定病毒病對各紫花苜蓿品種莖葉比的影響。并分析病情指數(shù)等7個性狀之間的相關性,基于這7個性狀表現(xiàn),對30個紫花苜蓿品種進行聚類分析,以期為進一步開展苜蓿種質(zhì)資源的評價和利用提供科學依據(jù)。
試驗地位于河南省新鄉(xiāng)市原陽縣平原示范區(qū)河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地,地處黃河流域下游,地下水資源豐富,常年平均地下水位在5~8 m,屬淡水,pH值為6~8,適宜農(nóng)作物灌溉;土質(zhì)為砂壤土,土壤有機質(zhì)含量高(10 g·kg-1左右);屬暖溫帶季風氣候,春季干旱風沙多,夏季炎熱雨集中,秋季光足溫差大,冬季干冷季節(jié)長。年平均氣溫14.4 ℃,全年無霜期224 d,全年日照1938 h,灌區(qū)冬春季盛行東北風、西北風,夏秋季盛行東南風、南風,年平均風速為3.4 m·s-1,瞬時最大風速為24 m·s-1。年季節(jié)變率較大,旱澇交替出現(xiàn),但旱多于澇,雨量多集中在6-9月,占全年降水量的71%左右。
試驗地為河南省新鄉(xiāng)市原陽縣平原示范區(qū)河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地內(nèi)的一塊連片的矩形平整地塊,播種前統(tǒng)一翻耙、整地,并分好區(qū)塊。于2013年9月隨機播種30個紫花苜蓿品種(表1),每個品種種植3個區(qū)塊,每個區(qū)塊占地面積2 m×5 m,各區(qū)塊間相隔0.5 m,種植過程中正常管理,不施肥、不噴灑農(nóng)藥,僅進行人工除草。于2017年4月25日對苜蓿各項指標進行測定。
1.3.1發(fā)病率和病情指數(shù)測定 采用“W”形調(diào)查法,每個苜蓿品種調(diào)查5個樣方,每個樣方面積為0.71 m×0.71 m,每個樣方調(diào)查20株,共100株,記錄所調(diào)查苜蓿植株發(fā)病數(shù),計算發(fā)病率,根據(jù)苜蓿病毒病的分級標準(表2)計算病情指數(shù)[6],具體如下:
發(fā)病率病情指數(shù)
表 2 苜蓿病毒病分級標準Table 2 Classification standard of alfalfa virus disease
1.3.2相對株高、相對單株干重和相對莖稈直徑的測定 每個品種選取有代表性的健康植株和發(fā)病植株各6株,測株高(地面量至最高處垂直距離)、單株干重(將單株鮮樣放入信封袋中,在烘箱中105 ℃殺青25 min,65 ℃烘干24 h后測其干重)和莖稈直徑(每株苜蓿從頂部下數(shù)第4節(jié)莖稈的中部測其直徑)。根據(jù)如下公式計算相對株高、相對單株干重和相對莖稈直徑:
1.3.3相對葉面積、相對葉長、相對葉寬和相對葉莖比的測定 選取植株從頂部下數(shù)第2節(jié)處的三小葉,用數(shù)字式葉面積儀(ADC生物科學有限公司,設備類型:AM300-002,序列號:31848)測其葉面積、葉長和葉寬,每個苜蓿品種選取健康植株和發(fā)病植株各9株。根據(jù)如下公式計算相對葉面積、相對葉長和相對葉寬:
刈割留茬高度4 cm,每個品種取健康植株和發(fā)病植株各500 g鮮草進行莖葉分離,分別稱重,在烘箱中105 ℃殺青25 min,65 ℃烘干24 h后稱重,計算葉莖比。根據(jù)如下公式計算相對葉莖比:
將調(diào)查采集的30個紫花苜蓿品種病葉樣用錫箔紙包被并做好標記,立即放入液氮速凍,回到實驗室后立即保存在-80 ℃冰箱備用,用北京艾德萊生物科技有限公司的EASY spin植物micro RNA快速提取試劑盒,分別提取30個紫花苜蓿品種的病樣總RNA,并送至北京百邁客生物科技有限公司進行小RNA深度測序。通過對測序數(shù)據(jù)的過濾、拼接、BLAST分析初步篩查病毒相關序列,隨后利用反轉(zhuǎn)錄PCR擴增和克隆測序技術進一步確定病毒種類。
采用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)的處理,采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較[21];利用DPS 6.55軟件對30個紫花苜蓿品種的部分性狀進行相關性分析和系統(tǒng)聚類分析。
田間調(diào)查發(fā)現(xiàn),苜蓿感染病毒病原后,主要有以下癥狀類型(圖1)。黃斑花葉:沿葉脈產(chǎn)生相間的黃色條點,嚴重的出現(xiàn)黃條斑,并產(chǎn)生黃條狀或者不規(guī)則形狀花葉(圖1A);斑駁花葉:葉面整體凹凸不平,出現(xiàn)黃綠斑點或者黃綠相間花葉(圖1B);黃化:植株葉面整體黃化發(fā)亮,葉脈也出現(xiàn)黃化(圖1C);皺縮:葉片無規(guī)則扭曲皺縮,不能展平,葉片顏色并未發(fā)生變化(圖1D);花葉皺縮:葉面無規(guī)則扭曲皺縮,不能展平,葉片出現(xiàn)黃色斑點或者花色條紋,植株出現(xiàn)褪綠現(xiàn)象(圖1E);叢簇矮化:植株明顯矮小,中上部葉片無規(guī)則扭曲皺縮,不能展平,有的皺縮葉片有壞死征兆(圖1F)。
圖1 苜蓿病毒病田間癥狀類型Fig.1 Symptom types of alfalfa virus disease in the field A: 黃斑花葉Macular mosaic; B: 斑駁花葉Mottle mosaic; C: 黃化Etiolation; D: 皺縮Shrinkage; E: 花葉皺縮Mosaic shrinkage; F: 矮化Dwarf; G: 健康Healthy.
30個苜蓿品種病樣經(jīng)過小RNA測序、過濾、拼接后,將拼接片段比對至NCBI病毒核酸數(shù)據(jù)庫,BLASTn初步比對到3種病毒:苜?;ㄈ~病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)、苜蓿卷葉病毒(alfalfa leaf curl virus, ALCV)和苜蓿矮縮病毒(alfalfa dwarf virus, ADV)。之后利用這些拼接片段設計引物,利用RT-PCR和克隆測序技術進一步驗證侵染苜蓿的病毒種類,最終只有AMV擴增出特異片段(上游引物-F序列5′-3′:AACGGTGCGTATAGATGCCG,下游引物-R序列5′-3′:TTAATCCACCCAGTGGAGGTCA),該特異片段大小為876 bp,其中包含AMV的外殼蛋白基因組全序列(圖2)。之后將該片段克隆測序并與NCBI中的AMV外殼蛋白基因(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號:MF075254.1)進行同源性比對,其同源性均超過了95%,因此可以判定這30個苜蓿品種均受到了苜?;ㄈ~病毒的侵染。
圖2 PCR驗證AMV的存在Fig.2 PCR validation for the presence of the AMV M代表DNA分子量標準;1~30分別代表利用F和R引物對對30個苜蓿品種的病樣擴增得到的特異條帶。M represents DNA marker (DL 1000 DNA Marker). Lane 1 to 30 represent PCR using primers of F and R of 30 alfalfa varieties, respectively.
30個苜蓿品種的田間發(fā)病率均超過了90%(表3),除大富豪外的其余29個苜蓿品種的田間發(fā)病率均超過了95%,驚喜、WL-903、三得利、金皇后、獵人河、維多利亞、飛馬、愛菲尼特、賽迪和四季旺的田間發(fā)病率均為100%,顯著高于WL-525、和田大葉和大富豪(P<0.05)。30個苜蓿品種的病情指數(shù)范圍為31.53~55.50,從病情指數(shù)上來看,不同苜蓿品種間的抗病性有所不同,其中,頂點的抗病性最強(病情指數(shù)為31.53),驚喜的抗病性最弱(55.50),顯著弱于除WL-903、敖漢、8920MF、兼用苜蓿、苜蓿王和皇后2000外的其余23個苜蓿品種(P<0.05);豐葉721、盛世、阿迪娜和大富豪的抗病性較強(33.95~37.19),WL-903、敖漢、8920MF、兼用苜蓿、苜蓿王和皇后2000的抗病性較弱(46.31~52.51),其余18個苜蓿品種的抗病性中等。
30個苜蓿品種的表觀指標與對照相比有所不同,不同品種間的同一指標也各有差異(表4)。從相對株高來看,30個苜蓿品種均低于對照,其中,敖漢的抗病性最強(相對株高為0.93),顯著強于除和田大葉、兼用苜蓿、苜蓿王、豐葉721和大富豪外的其余24個苜蓿品種(P<0.05),賽迪的抗病性最弱(0.43),顯著弱于除8920MF外的其余28個苜蓿品種(P<0.05);和田大葉、兼用苜蓿、苜蓿王、豐葉721和大富豪的抗病性較強(0.80~0.92),8920MF、豐寶、WL-525、阿爾岡金、盛世和先行者的抗病性較弱(0.47~0.64),其余17個苜蓿品種的抗病性中等。
從相對單株干重來看,病毒病對各品種苜蓿的影響較大,除了射手2號、飛馬、獵人河和皇后2000外的其余26個苜蓿品種的相對單株干重均低于0.60,其中,射手2號的抗病性最強(相對單株干重為0.91),顯著強于除飛馬和獵人河外的其余27個苜蓿品種(P<0.05),賽迪的抗病性最弱(0.18);飛馬的抗病性較強(0.74),獵人河、皇后2000、德寶、苜蓿王和大富豪的抗病性中等(0.52~0.68),其余22個苜蓿品種的抗病性較弱,其相對單株干重均低于0.50。
從相對莖稈直徑來看,射手2號的抗病性最強(相對莖稈直徑為1.05),顯著強于除WL-903和維多利亞外的其余27個苜蓿品種(P<0.05),8920MF和盛世的抗病性最弱(均為0.60);WL-903、維多利亞、飛馬、皇后2000和和田大葉的抗病性較強(0.87~0.92),THG、賽迪、豐寶、愛菲尼特、兼用苜蓿、WL-525、敖漢、阿迪娜和三得利的抗病性較弱(0.63~0.69),其余13個苜蓿品種的抗病性中等。
表3 30個苜蓿品種的病毒病發(fā)病情況Table 3 Incidence of alfalfa virus disease of 30 alfalfa varieties
注:同列不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。下同。
Note:Values within the same column followed by the different lowercases are significantly different atP<0.05. The same below.
從相對葉面積來看,射手2號的抗病性最強(相對葉面積為0.99),顯著強于除維多利亞和德寶外的其余27個苜蓿品種(P<0.05),敖漢的抗病性最弱(0.33),顯著弱于除胖多、THG、豐寶、兼用苜蓿和WL-903外的其余24個苜蓿品種(P<0.05);維多利亞、德寶和盛世的抗病性較強(0.80~0.97),胖多、THG、WL-903、豐寶、兼用苜蓿、先行者和阿迪娜的抗病性較弱(0.37~0.49),其余18個苜蓿品種的抗病性中等。
30個苜蓿品種間的相對葉長和相對葉寬的差異與葉面積類似,從相對葉長來看,德寶、射手2號、苜蓿王、四季旺、飛馬、和維多利亞的抗病性較強(0.82~0.95);敖漢、胖多、先行者、豐寶、WL-903和兼用苜蓿的抗病性較弱(0.44~0.58)。從相對葉寬來看,維多利亞、射手2號、盛世、WL-525、金皇后、德寶、飛馬、和田大葉和8920MF的抗病性較強(0.90~1.18);THG、胖多、兼用苜蓿、獵人河、敖漢、豐寶和WL903的抗病性較弱(0.65~0.74)。
30個苜蓿品種的相對葉莖比與對照相比,差異各有不同(圖3),有21個苜蓿品種的相對葉莖比高于對照,其中,豐寶(1.79)、賽迪(1.54)和先行者(1.40)的相對葉莖比極顯著高于對照(P<0.01),驚喜(1.31)、大富豪(1.30)、WL-903(1.29)、維多利亞(1.28)、WL-525(1.28)和盛世(1.28)的相對葉莖比顯著高于對照(P<0.05),其余12個苜蓿品種的相對葉莖比為1.00~1.24,與對照相比差異不顯著(P>0.05);剩余的9個苜蓿品種的相對葉莖比均低于對照,其中兼用苜蓿(0.59)的相對葉莖比極顯著均低于對照(P<0.01),其余8個苜蓿品種的相對葉莖比為0.75~1.00,與對照相比差異不顯著(P>0.05)。
表4 苜蓿病毒病對30個紫花苜蓿品種表觀指標的影響Table 4 Effect of alfalfa virus disease on plant appearance index of 30 alfalfa varieties
由表5可知,相對單株干重與相對莖稈直徑、相對葉面積、相對葉長的相關系數(shù)分別為0.61、0.37和0.41,達到顯著正相關(P<0.05),其中單株干重與相對莖稈直徑達到極顯著正相關(P<0.01);相對莖稈直徑與相對葉面積的相關系數(shù)為0.38,達到顯著正相關(P<0.05);相對葉面積與相對葉長、相對葉寬的關系數(shù)均為0.87,達到極顯著正相關(P<0.01);相對葉長與相對葉寬的相關系數(shù)為0.54,達到極顯著正相關(P<0.01);病情指數(shù)與其余6個農(nóng)藝性狀間的相關性均不顯著(P>0.05)。
圖3 苜蓿病毒病對30個苜蓿品種相對葉莖比的影響Fig.3 Effect of alfalfa virus disease on plant appearance index of 30 alfalfa varieties *表示在P<0.05水平上顯著差異,**表示在P<0.01水平上極顯著差異。* indicates significant difference at P<0.05 level, ** indicates significant difference at P<0.01 level.
性狀CharacterX2X3X4X5X6YX10.240.27-0.14-0.07-0.110.00X20.61??0.37? 0.41? 0.180.05X30.38? 0.300.340.02X40.87??0.87??-0.21X50.54??-0.20X6-0.22
X1:相對株高Relative plant height;X2:相對單株干重Relative dry weight per plant;X3:相對莖稈直徑Relative stem diameter;X4:相對葉面積Relative leaf area;X5:相對葉長Relative leaf length;X6:相對葉寬Relative leaf width;Y:病情指數(shù)Disease index.*:P<0.05;**:P<0.01.
將各苜蓿品種的病情指數(shù)、株高、單株干重、莖稈直徑、葉面積、葉長和葉寬分別作為指標,由于各指標的調(diào)查量綱不同,首先對各指標的平均數(shù)進行標準化處理,采用系統(tǒng)聚類,聚類距離運用歐氏距離,采用最短距離法,對30個苜蓿品種進行聚類分析(圖4)。在2.60距離水平上,30個苜蓿品種聚類分為2個組群,第一組群只有射手2號一個苜蓿品種,占3.33%;第二組群有29個苜蓿品種,占96.67%。在2.40距離水平上,第二組群又可以分為3個亞群,以此類推。從聚類結(jié)果可以看出,綜合抗病性較強的品種射手2號與其他苜蓿品種的親緣關系較遠,利用射手2號品種與其他苜蓿品種雜交可能產(chǎn)生較大的雜交優(yōu)勢。
田間調(diào)查表明,30個苜蓿品種的田間發(fā)病率為94.07%~100%,說明在田間這些苜蓿品種對病毒病并無絕對抗性。本研究調(diào)查苜蓿病毒病的田間發(fā)病率和病情指數(shù)(31.53~55.50)均高于周其宇等[6]的田間調(diào)查結(jié)果(田間發(fā)病率為16.08%~43.33%,病情指數(shù)為6.25~26.08)。薊馬、蚜蟲、傳粉昆蟲等均可傳播病毒病[22],薊馬危害苜蓿后可加重苜蓿的病害表現(xiàn)[6],本研究試驗地周圍雜草較多,夏季蟲害較為嚴重,伴隨著害蟲的繁殖,將更加有利于苜蓿病毒病的傳播,加重病情[23],這可能是影響調(diào)查結(jié)果的一個主要原因;另外苜蓿病害隨著種植年限的增長而加重[13],本研究的苜蓿品種均為種植的第5個年頭,種植年限較長,加重了病害程度的積累,這可能是造成此結(jié)果的另一個主要原因。
圖4 30個苜蓿品種7個性狀遺傳關系聚類分析Fig.4 Dendrogram of genetic affinity based on the 7 characters analysis in 30 alfalfa varieties
從各指標的相關分析結(jié)果可以看出,供試苜蓿品種的病情指數(shù)和株高、單株干重、莖稈直徑、葉面積、葉長、葉寬均無顯著相關性,史鳳玉等[24]在野生大豆(Glycinesoja)病毒病的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)病情指數(shù)和株高、葉色、葉形、單莢粒數(shù)、莖色、茸毛色等農(nóng)藝性狀均無顯著相關性,本研究結(jié)果與此類似。在苜蓿病毒病對苜蓿品種葉莖比的影響中發(fā)現(xiàn),30個苜蓿品種中,21個苜蓿品種的葉莖比高于對照,9個苜蓿品種的葉莖比低于對照,可能是病毒侵染苜蓿后,對不同品種苜蓿葉和莖的影響不同,僅從本研究可以看出病毒病對多數(shù)苜蓿品種莖的抑制作用要強于葉,具體原因有待于進一步研究。
史鳳玉等[24]、彭冠云[25]、陳博等[26]對病毒病的抗性評價中僅以病情指數(shù)作為評價指標,采用單一指標來評價苜蓿的抗病性存在不穩(wěn)定性和片面性,用多個指標進行綜合評價才較為可靠[27]。根據(jù)病情指數(shù)、株高、單株干重、莖稈直徑、葉面積、葉長和葉寬指標的綜合評定,射手2號對苜蓿病毒病的抗性較強,飛馬、獵人河、德寶、大富豪、豐葉721和皇后2000對苜蓿病毒病的抗性一般,其余23個苜蓿品種對苜蓿病毒病的抗性較差,分別占供試品種的3.33%,20.00%和76.67%。這與大豆在病毒病的抗性結(jié)果類似[28],也與苜蓿對其他葉部病害的抗性結(jié)果類似[29-30],大多數(shù)品種屬于高感或者感病,少數(shù)品種具有較好的抗性,缺少高抗品種。
將遺傳距離較遠的2個材料進行雜交,可能獲得較大的雜種優(yōu)勢[31]。通過聚類分析的方法可直觀看出各品種間的距離[32]。本研究通過對各苜蓿品種的7個農(nóng)藝性狀的聚類分析發(fā)現(xiàn),抗病毒病較好的射手2號與其他苜蓿品種的親緣關系較遠,在苜蓿育種中,通過射手2號與其他農(nóng)藝性狀表現(xiàn)良好的苜蓿品種進行雜交,可能拓寬苜蓿遺傳育種的種質(zhì),選育出質(zhì)優(yōu)高產(chǎn)抗病的苜蓿品種。