郭志鵬，馮長松，張靖雪，王苗利，曲根，劉建宇，管永卓，張曉婷，郭玉霞*，嚴學兵

(1.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧所，河南 鄭州 450002；3.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225000)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培最早、種植面積最大、利用價值最高的一種多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草[1]，有“牧草之王”的美譽[2]。其在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中有著不可替代的作用[3]。我國是畜牧大國，對苜蓿草的需求很大，2015年我國的苜蓿商品干草產(chǎn)量為123萬t，進口苜蓿為121萬t[4]。農(nóng)業(yè)部發(fā)布的苜蓿產(chǎn)業(yè)“十三五”規(guī)劃提出，到2020年，全國優(yōu)質(zhì)苜蓿產(chǎn)量將達到540萬t[5]。隨著我國苜蓿種植面積的不斷增加以及種植年限的延長，苜蓿病毒病害的發(fā)生越來越嚴重，已成為限制苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因之一[6]。目前國內(nèi)對苜蓿病毒病的研究甚少，韓玉靜等[7]、張麗[8]、王瑜等[9]、張蓉等[10]、楊雨翠[11]和張芯偽[12]僅僅調(diào)查了苜?；ㄈ~病的田間發(fā)病率。周其宇等[6]通過病原檢測對侵染苜蓿的苜?；ㄈ~病毒、白三葉(Trifoliumrepens)花葉病毒、菜豆(Phaseolusvulgaris)黃花葉病毒和豇豆(Vignaunguiculata)花葉病毒進行了鑒定，并測定了這4種病毒的寄主范圍。南志標[13]研究了苜?；ㄈ~病對苜蓿田間產(chǎn)量和質(zhì)量的影響。國外的研究發(fā)現(xiàn)侵染苜蓿的病毒至少有31種[14-20]。

以往在苜蓿病毒病的研究中，多是在病毒種類的鑒定上進行試驗，有關苜蓿不同品種對病毒病的抗性研究尚未見報道。目前，國內(nèi)栽培的苜蓿品種繁多，不同地區(qū)不同品種的抗性表現(xiàn)不同，在引種苜蓿時，評價不同品種苜蓿對病毒病的抗性是很有必要的，以篩選適應本地種植的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的苜蓿品種。本研究利用小RNA深度測序技術結合RT-PCR技術檢測鑒定30個紫花苜蓿品種中的病毒種類，并測定各紫花苜蓿品種的發(fā)病率、病情指數(shù)、相對株高、相對單株干重、相對莖稈直徑、相對葉面積、相對葉長和相對葉寬，比較各紫花苜蓿品種的抗性表現(xiàn)，篩選出抗性較強的品種，同時測定病毒病對各紫花苜蓿品種莖葉比的影響。并分析病情指數(shù)等7個性狀之間的相關性，基于這7個性狀表現(xiàn)，對30個紫花苜蓿品種進行聚類分析，以期為進一步開展苜蓿種質(zhì)資源的評價和利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于河南省新鄉(xiāng)市原陽縣平原示范區(qū)河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地，地處黃河流域下游，地下水資源豐富，常年平均地下水位在5～8 m，屬淡水，pH值為6～8，適宜農(nóng)作物灌溉；土質(zhì)為砂壤土，土壤有機質(zhì)含量高(10 g·kg-1左右)；屬暖溫帶季風氣候，春季干旱風沙多，夏季炎熱雨集中，秋季光足溫差大，冬季干冷季節(jié)長。年平均氣溫14.4 ℃，全年無霜期224 d，全年日照1938 h，灌區(qū)冬春季盛行東北風、西北風，夏秋季盛行東南風、南風，年平均風速為3.4 m·s-1，瞬時最大風速為24 m·s-1。年季節(jié)變率較大，旱澇交替出現(xiàn)，但旱多于澇，雨量多集中在6-9月，占全年降水量的71%左右。

1.2 田間實驗設計

試驗地為河南省新鄉(xiāng)市原陽縣平原示范區(qū)河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地內(nèi)的一塊連片的矩形平整地塊，播種前統(tǒng)一翻耙、整地，并分好區(qū)塊。于2013年9月隨機播種30個紫花苜蓿品種(表1)，每個品種種植3個區(qū)塊，每個區(qū)塊占地面積2 m×5 m，各區(qū)塊間相隔0.5 m，種植過程中正常管理，不施肥、不噴灑農(nóng)藥，僅進行人工除草。于2017年4月25日對苜蓿各項指標進行測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1發(fā)病率和病情指數(shù)測定 采用“W”形調(diào)查法，每個苜蓿品種調(diào)查5個樣方，每個樣方面積為0.71 m×0.71 m，每個樣方調(diào)查20株，共100株，記錄所調(diào)查苜蓿植株發(fā)病數(shù)，計算發(fā)病率，根據(jù)苜蓿病毒病的分級標準(表2)計算病情指數(shù)[6]，具體如下：

發(fā)病率病情指數(shù)

表 2 苜蓿病毒病分級標準Table 2 Classification standard of alfalfa virus disease

1.3.2相對株高、相對單株干重和相對莖稈直徑的測定 每個品種選取有代表性的健康植株和發(fā)病植株各6株，測株高(地面量至最高處垂直距離)、單株干重(將單株鮮樣放入信封袋中，在烘箱中105 ℃殺青25 min，65 ℃烘干24 h后測其干重)和莖稈直徑(每株苜蓿從頂部下數(shù)第4節(jié)莖稈的中部測其直徑)。根據(jù)如下公式計算相對株高、相對單株干重和相對莖稈直徑：

1.3.3相對葉面積、相對葉長、相對葉寬和相對葉莖比的測定 選取植株從頂部下數(shù)第2節(jié)處的三小葉，用數(shù)字式葉面積儀(ADC生物科學有限公司，設備類型：AM300-002，序列號：31848)測其葉面積、葉長和葉寬，每個苜蓿品種選取健康植株和發(fā)病植株各9株。根據(jù)如下公式計算相對葉面積、相對葉長和相對葉寬：

刈割留茬高度4 cm，每個品種取健康植株和發(fā)病植株各500 g鮮草進行莖葉分離，分別稱重，在烘箱中105 ℃殺青25 min，65 ℃烘干24 h后稱重，計算葉莖比。根據(jù)如下公式計算相對葉莖比：

1.4 苜蓿病毒種類的分子生物學驗證

將調(diào)查采集的30個紫花苜蓿品種病葉樣用錫箔紙包被并做好標記，立即放入液氮速凍，回到實驗室后立即保存在-80 ℃冰箱備用，用北京艾德萊生物科技有限公司的EASY spin植物micro RNA快速提取試劑盒，分別提取30個紫花苜蓿品種的病樣總RNA，并送至北京百邁客生物科技有限公司進行小RNA深度測序。通過對測序數(shù)據(jù)的過濾、拼接、BLAST分析初步篩查病毒相關序列，隨后利用反轉(zhuǎn)錄PCR擴增和克隆測序技術進一步確定病毒種類。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)的處理，采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較[21]；利用DPS 6.55軟件對30個紫花苜蓿品種的部分性狀進行相關性分析和系統(tǒng)聚類分析。

2 結果與分析

2.1 苜蓿病毒病的田間癥狀類型

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，苜蓿感染病毒病原后，主要有以下癥狀類型(圖1)。黃斑花葉：沿葉脈產(chǎn)生相間的黃色條點，嚴重的出現(xiàn)黃條斑，并產(chǎn)生黃條狀或者不規(guī)則形狀花葉(圖1A)；斑駁花葉：葉面整體凹凸不平，出現(xiàn)黃綠斑點或者黃綠相間花葉(圖1B)；黃化：植株葉面整體黃化發(fā)亮，葉脈也出現(xiàn)黃化(圖1C)；皺縮：葉片無規(guī)則扭曲皺縮，不能展平，葉片顏色并未發(fā)生變化(圖1D)；花葉皺縮：葉面無規(guī)則扭曲皺縮，不能展平，葉片出現(xiàn)黃色斑點或者花色條紋，植株出現(xiàn)褪綠現(xiàn)象(圖1E)；叢簇矮化：植株明顯矮小，中上部葉片無規(guī)則扭曲皺縮，不能展平，有的皺縮葉片有壞死征兆(圖1F)。

圖1 苜蓿病毒病田間癥狀類型Fig.1 Symptom types of alfalfa virus disease in the field A: 黃斑花葉Macular mosaic; B: 斑駁花葉Mottle mosaic; C: 黃化Etiolation; D: 皺縮Shrinkage; E: 花葉皺縮Mosaic shrinkage; F: 矮化Dwarf; G: 健康Healthy.

2.2 苜蓿樣品病毒種類的檢測

30個苜蓿品種病樣經(jīng)過小RNA測序、過濾、拼接后，將拼接片段比對至NCBI病毒核酸數(shù)據(jù)庫，BLASTn初步比對到3種病毒：苜?；ㄈ~病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)、苜蓿卷葉病毒(alfalfa leaf curl virus, ALCV)和苜蓿矮縮病毒(alfalfa dwarf virus, ADV)。之后利用這些拼接片段設計引物，利用RT-PCR和克隆測序技術進一步驗證侵染苜蓿的病毒種類，最終只有AMV擴增出特異片段(上游引物-F序列5′-3′：AACGGTGCGTATAGATGCCG，下游引物-R序列5′-3′：TTAATCCACCCAGTGGAGGTCA)，該特異片段大小為876 bp，其中包含AMV的外殼蛋白基因組全序列(圖2)。之后將該片段克隆測序并與NCBI中的AMV外殼蛋白基因(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號：MF075254.1)進行同源性比對，其同源性均超過了95%，因此可以判定這30個苜蓿品種均受到了苜?；ㄈ~病毒的侵染。

圖2 PCR驗證AMV的存在Fig.2 PCR validation for the presence of the AMV M代表DNA分子量標準；1～30分別代表利用F和R引物對對30個苜蓿品種的病樣擴增得到的特異條帶。M represents DNA marker (DL 1000 DNA Marker). Lane 1 to 30 represent PCR using primers of F and R of 30 alfalfa varieties, respectively.

2.3 苜蓿病毒病的田間發(fā)病情況

30個苜蓿品種的田間發(fā)病率均超過了90%(表3)，除大富豪外的其余29個苜蓿品種的田間發(fā)病率均超過了95%，驚喜、WL-903、三得利、金皇后、獵人河、維多利亞、飛馬、愛菲尼特、賽迪和四季旺的田間發(fā)病率均為100%，顯著高于WL-525、和田大葉和大富豪(P<0.05)。30個苜蓿品種的病情指數(shù)范圍為31.53～55.50，從病情指數(shù)上來看，不同苜蓿品種間的抗病性有所不同，其中，頂點的抗病性最強(病情指數(shù)為31.53)，驚喜的抗病性最弱(55.50)，顯著弱于除WL-903、敖漢、8920MF、兼用苜蓿、苜蓿王和皇后2000外的其余23個苜蓿品種(P<0.05)；豐葉721、盛世、阿迪娜和大富豪的抗病性較強(33.95～37.19)，WL-903、敖漢、8920MF、兼用苜蓿、苜蓿王和皇后2000的抗病性較弱(46.31～52.51)，其余18個苜蓿品種的抗病性中等。

2.4 苜蓿病毒病對30個紫花苜蓿品種表觀指標的影響

30個苜蓿品種的表觀指標與對照相比有所不同，不同品種間的同一指標也各有差異(表4)。從相對株高來看，30個苜蓿品種均低于對照，其中，敖漢的抗病性最強(相對株高為0.93)，顯著強于除和田大葉、兼用苜蓿、苜蓿王、豐葉721和大富豪外的其余24個苜蓿品種(P<0.05)，賽迪的抗病性最弱(0.43)，顯著弱于除8920MF外的其余28個苜蓿品種(P<0.05)；和田大葉、兼用苜蓿、苜蓿王、豐葉721和大富豪的抗病性較強(0.80～0.92)，8920MF、豐寶、WL-525、阿爾岡金、盛世和先行者的抗病性較弱(0.47～0.64)，其余17個苜蓿品種的抗病性中等。

從相對單株干重來看，病毒病對各品種苜蓿的影響較大，除了射手2號、飛馬、獵人河和皇后2000外的其余26個苜蓿品種的相對單株干重均低于0.60，其中，射手2號的抗病性最強(相對單株干重為0.91)，顯著強于除飛馬和獵人河外的其余27個苜蓿品種(P<0.05)，賽迪的抗病性最弱(0.18)；飛馬的抗病性較強(0.74)，獵人河、皇后2000、德寶、苜蓿王和大富豪的抗病性中等(0.52～0.68)，其余22個苜蓿品種的抗病性較弱，其相對單株干重均低于0.50。

從相對莖稈直徑來看，射手2號的抗病性最強(相對莖稈直徑為1.05)，顯著強于除WL-903和維多利亞外的其余27個苜蓿品種(P<0.05)，8920MF和盛世的抗病性最弱(均為0.60)；WL-903、維多利亞、飛馬、皇后2000和和田大葉的抗病性較強(0.87～0.92)，THG、賽迪、豐寶、愛菲尼特、兼用苜蓿、WL-525、敖漢、阿迪娜和三得利的抗病性較弱(0.63～0.69)，其余13個苜蓿品種的抗病性中等。

表3 30個苜蓿品種的病毒病發(fā)病情況Table 3 Incidence of alfalfa virus disease of 30 alfalfa varieties

注：同列不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。下同。

Note：Values within the same column followed by the different lowercases are significantly different atP<0.05. The same below.

從相對葉面積來看，射手2號的抗病性最強(相對葉面積為0.99)，顯著強于除維多利亞和德寶外的其余27個苜蓿品種(P<0.05)，敖漢的抗病性最弱(0.33)，顯著弱于除胖多、THG、豐寶、兼用苜蓿和WL-903外的其余24個苜蓿品種(P<0.05)；維多利亞、德寶和盛世的抗病性較強(0.80～0.97)，胖多、THG、WL-903、豐寶、兼用苜蓿、先行者和阿迪娜的抗病性較弱(0.37～0.49)，其余18個苜蓿品種的抗病性中等。

30個苜蓿品種間的相對葉長和相對葉寬的差異與葉面積類似，從相對葉長來看，德寶、射手2號、苜蓿王、四季旺、飛馬、和維多利亞的抗病性較強(0.82～0.95)；敖漢、胖多、先行者、豐寶、WL-903和兼用苜蓿的抗病性較弱(0.44～0.58)。從相對葉寬來看，維多利亞、射手2號、盛世、WL-525、金皇后、德寶、飛馬、和田大葉和8920MF的抗病性較強(0.90～1.18)；THG、胖多、兼用苜蓿、獵人河、敖漢、豐寶和WL903的抗病性較弱(0.65～0.74)。

2.5 苜蓿病毒病對30個紫花苜蓿品種葉莖比的影響

30個苜蓿品種的相對葉莖比與對照相比，差異各有不同(圖3)，有21個苜蓿品種的相對葉莖比高于對照，其中，豐寶(1.79)、賽迪(1.54)和先行者(1.40)的相對葉莖比極顯著高于對照(P<0.01)，驚喜(1.31)、大富豪(1.30)、WL-903(1.29)、維多利亞(1.28)、WL-525(1.28)和盛世(1.28)的相對葉莖比顯著高于對照(P<0.05)，其余12個苜蓿品種的相對葉莖比為1.00～1.24，與對照相比差異不顯著(P>0.05)；剩余的9個苜蓿品種的相對葉莖比均低于對照，其中兼用苜蓿(0.59)的相對葉莖比極顯著均低于對照(P<0.01)，其余8個苜蓿品種的相對葉莖比為0.75～1.00，與對照相比差異不顯著(P>0.05)。

表4 苜蓿病毒病對30個紫花苜蓿品種表觀指標的影響Table 4 Effect of alfalfa virus disease on plant appearance index of 30 alfalfa varieties

2.6 不同苜蓿品種農(nóng)藝性狀間的相關分析

由表5可知，相對單株干重與相對莖稈直徑、相對葉面積、相對葉長的相關系數(shù)分別為0.61、0.37和0.41，達到顯著正相關(P<0.05)，其中單株干重與相對莖稈直徑達到極顯著正相關(P<0.01)；相對莖稈直徑與相對葉面積的相關系數(shù)為0.38，達到顯著正相關(P<0.05)；相對葉面積與相對葉長、相對葉寬的關系數(shù)均為0.87，達到極顯著正相關(P<0.01)；相對葉長與相對葉寬的相關系數(shù)為0.54，達到極顯著正相關(P<0.01)；病情指數(shù)與其余6個農(nóng)藝性狀間的相關性均不顯著(P>0.05)。

圖3 苜蓿病毒病對30個苜蓿品種相對葉莖比的影響Fig.3 Effect of alfalfa virus disease on plant appearance index of 30 alfalfa varieties *表示在P<0.05水平上顯著差異，**表示在P<0.01水平上極顯著差異。* indicates significant difference at P<0.05 level, ** indicates significant difference at P<0.01 level.

性狀CharacterX2X3X4X5X6YX10.240.27-0.14-0.07-0.110.00X20.61??0.37? 0.41? 0.180.05X30.38? 0.300.340.02X40.87??0.87??-0.21X50.54??-0.20X6-0.22

X1:相對株高Relative plant height;X2:相對單株干重Relative dry weight per plant;X3:相對莖稈直徑Relative stem diameter;X4:相對葉面積Relative leaf area;X5:相對葉長Relative leaf length;X6:相對葉寬Relative leaf width;Y:病情指數(shù)Disease index.*:P<0.05;**:P<0.01.

2.7 不同品種之間7個性狀的聚類分析

將各苜蓿品種的病情指數(shù)、株高、單株干重、莖稈直徑、葉面積、葉長和葉寬分別作為指標，由于各指標的調(diào)查量綱不同，首先對各指標的平均數(shù)進行標準化處理，采用系統(tǒng)聚類，聚類距離運用歐氏距離，采用最短距離法，對30個苜蓿品種進行聚類分析(圖4)。在2.60距離水平上，30個苜蓿品種聚類分為2個組群，第一組群只有射手2號一個苜蓿品種，占3.33%；第二組群有29個苜蓿品種，占96.67%。在2.40距離水平上，第二組群又可以分為3個亞群，以此類推。從聚類結果可以看出，綜合抗病性較強的品種射手2號與其他苜蓿品種的親緣關系較遠，利用射手2號品種與其他苜蓿品種雜交可能產(chǎn)生較大的雜交優(yōu)勢。

3 結論與討論

田間調(diào)查表明，30個苜蓿品種的田間發(fā)病率為94.07%～100%，說明在田間這些苜蓿品種對病毒病并無絕對抗性。本研究調(diào)查苜蓿病毒病的田間發(fā)病率和病情指數(shù)(31.53～55.50)均高于周其宇等[6]的田間調(diào)查結果(田間發(fā)病率為16.08%～43.33%，病情指數(shù)為6.25～26.08)。薊馬、蚜蟲、傳粉昆蟲等均可傳播病毒病[22]，薊馬危害苜蓿后可加重苜蓿的病害表現(xiàn)[6]，本研究試驗地周圍雜草較多，夏季蟲害較為嚴重，伴隨著害蟲的繁殖，將更加有利于苜蓿病毒病的傳播，加重病情[23]，這可能是影響調(diào)查結果的一個主要原因；另外苜蓿病害隨著種植年限的增長而加重[13]，本研究的苜蓿品種均為種植的第5個年頭，種植年限較長，加重了病害程度的積累，這可能是造成此結果的另一個主要原因。

圖4 30個苜蓿品種7個性狀遺傳關系聚類分析Fig.4 Dendrogram of genetic affinity based on the 7 characters analysis in 30 alfalfa varieties

從各指標的相關分析結果可以看出，供試苜蓿品種的病情指數(shù)和株高、單株干重、莖稈直徑、葉面積、葉長、葉寬均無顯著相關性，史鳳玉等[24]在野生大豆(Glycinesoja)病毒病的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)病情指數(shù)和株高、葉色、葉形、單莢粒數(shù)、莖色、茸毛色等農(nóng)藝性狀均無顯著相關性，本研究結果與此類似。在苜蓿病毒病對苜蓿品種葉莖比的影響中發(fā)現(xiàn)，30個苜蓿品種中，21個苜蓿品種的葉莖比高于對照，9個苜蓿品種的葉莖比低于對照，可能是病毒侵染苜蓿后，對不同品種苜蓿葉和莖的影響不同，僅從本研究可以看出病毒病對多數(shù)苜蓿品種莖的抑制作用要強于葉，具體原因有待于進一步研究。

史鳳玉等[24]、彭冠云[25]、陳博等[26]對病毒病的抗性評價中僅以病情指數(shù)作為評價指標，采用單一指標來評價苜蓿的抗病性存在不穩(wěn)定性和片面性，用多個指標進行綜合評價才較為可靠[27]。根據(jù)病情指數(shù)、株高、單株干重、莖稈直徑、葉面積、葉長和葉寬指標的綜合評定，射手2號對苜蓿病毒病的抗性較強，飛馬、獵人河、德寶、大富豪、豐葉721和皇后2000對苜蓿病毒病的抗性一般，其余23個苜蓿品種對苜蓿病毒病的抗性較差，分別占供試品種的3.33%，20.00%和76.67%。這與大豆在病毒病的抗性結果類似[28]，也與苜蓿對其他葉部病害的抗性結果類似[29-30]，大多數(shù)品種屬于高感或者感病，少數(shù)品種具有較好的抗性，缺少高抗品種。

將遺傳距離較遠的2個材料進行雜交，可能獲得較大的雜種優(yōu)勢[31]。通過聚類分析的方法可直觀看出各品種間的距離[32]。本研究通過對各苜蓿品種的7個農(nóng)藝性狀的聚類分析發(fā)現(xiàn)，抗病毒病較好的射手2號與其他苜蓿品種的親緣關系較遠，在苜蓿育種中，通過射手2號與其他農(nóng)藝性狀表現(xiàn)良好的苜蓿品種進行雜交，可能拓寬苜蓿遺傳育種的種質(zhì)，選育出質(zhì)優(yōu)高產(chǎn)抗病的苜蓿品種。