閔學(xué)陽(yáng)，韋興燚，劉文獻(xiàn)，張正社，金小煜，NDAYAMBAZA Boniface，吳洪林，李昱，王彥榮

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020)

遺傳育種材料來(lái)源的選擇，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、遺傳改良具有重要意義，另外，遺傳多樣性很大程度上決定了種質(zhì)資源的豐富度，是物種適應(yīng)外界環(huán)境和進(jìn)化的前提；同時(shí)，遺傳多樣性研究能夠反映栽培物種的育種水平、發(fā)現(xiàn)新的基因資源和改良現(xiàn)有的育種材料[1-3]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的興起，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已被應(yīng)用于植物分類、品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析等研究中[4-6]。其中，簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats,SSR)分子標(biāo)記具有共顯性、單堿基高分辨率、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、可檢測(cè)等位基因和隨機(jī)均勻分布在擴(kuò)增基因組內(nèi)等優(yōu)點(diǎn)，已成為植物雜交育種和種群遺傳多樣性等研究領(lǐng)域中最常用的分子標(biāo)記之一[7-8]。因此，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析物種遺傳差異，將為物種遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助育種的研究奠定基礎(chǔ)。

箭筈豌豆(Viciasativa)作為一種重要的一年生、自花授粉、二倍體豆科牧草，具有生育周期短、較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)具有固氮、改善土壤結(jié)構(gòu)、廣泛的適應(yīng)性和良好的抗寒能力，是一種優(yōu)良的飼草和綠肥兼用牧草，在土耳其、中國(guó)、中亞、南美等地區(qū)普遍種植[9-11]。但目前對(duì)箭筈豌豆遺傳結(jié)構(gòu)及群體多樣性的研究相對(duì)較少，分子標(biāo)記數(shù)量十分有限，遠(yuǎn)不能滿足箭筈豌豆遺傳多樣性研究與分子育種工作的需要。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和成本的降低，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘有價(jià)值的SSR位點(diǎn)已在多種植物中得到了成功驗(yàn)證。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TFs)是一類能夠直接或間接與基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用，能夠激活或抑制下游被調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[12-13]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和基因組學(xué)工具的開(kāi)發(fā)使用，許多物種的轉(zhuǎn)錄因子已被鑒定和注釋。截至目前，已從高等植物中分離鑒定出100多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族[14]。由于轉(zhuǎn)錄因子的可用性、連續(xù)富集和明確的功能域，可作為優(yōu)異的候選基因用于開(kāi)發(fā)基于基因功能的微衛(wèi)星標(biāo)記[6]。迄今為止，轉(zhuǎn)錄因子分子標(biāo)記只在鷹嘴豆(Cicerarietinum)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中被研究報(bào)道，并且這些標(biāo)記已被證明在標(biāo)記輔助遺傳改良和品種鑒定中具有很大的潛力[6,15]。

新《種子法》的實(shí)施明確規(guī)定，申請(qǐng)審定的農(nóng)作物品種應(yīng)具備特異性(distinctness)、一致性(uniformity)、穩(wěn)定性(stability)簡(jiǎn)稱DUS，DUS測(cè)試結(jié)果已成為農(nóng)作物品種審定登記的必要條件。在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)技術(shù)試驗(yàn)示范(國(guó)家草品種區(qū)域試驗(yàn))項(xiàng)目的資助下，本團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了箭筈豌豆品種的評(píng)價(jià)和測(cè)試分析試驗(yàn)。為了從分子水平研究箭筈豌豆品種間基因型的差異，本研究采用基于箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘的轉(zhuǎn)錄因子SSR引物，利用30份箭筈豌豆品種構(gòu)建品種指紋圖譜，并在此基礎(chǔ)上對(duì)品種間的遺傳相似性進(jìn)行分析，從分子水平上為箭筈豌豆品種的鑒定和保護(hù)提供更加準(zhǔn)確、公正和客觀的判定依據(jù)。同時(shí)印證基于箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定其轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的可行性，以期為箭筈豌豆遺傳多樣性分析、品種鑒定和指紋圖譜構(gòu)建提供有價(jià)值的候選標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的30個(gè)箭筈豌豆品種由國(guó)內(nèi)和國(guó)外兩部分構(gòu)成。其中，20份國(guó)外品種來(lái)源于美國(guó)農(nóng)業(yè)部，10份國(guó)內(nèi)品種來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部全國(guó)畜牧總站和國(guó)家草種質(zhì)資源庫(kù)(表 1)，上述箭筈豌豆品種均種植于蘭州大學(xué)榆中校區(qū)試驗(yàn)站，實(shí)驗(yàn)材料在2017年5月采集于榆中校區(qū)試驗(yàn)田。

1.2 基因組DNA的提取

每個(gè)箭筈豌豆品種采集10個(gè)單株的新鮮葉片分別提取基因組DNA[6,16]。提取后的DNA經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，并用Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和質(zhì)量(OD260/OD280≈1.8)。將檢測(cè)合格的DNA樣品稀釋至50 μg·L-1，最后把同一品種的10份DNA稀釋液等體積混合，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 轉(zhuǎn)錄因子和SSR位點(diǎn)鑒定及引物設(shè)計(jì)

用于鑒定箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄因子和開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記的44582條箭筈豌豆 Unigene序列下載于NCBI Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為：No.GSE35437。豆科植物轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列下載于豆科轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(legume transcription factor database, Legume TFDB)。利用本地BLAST程序(E-value=10-10)與箭筈豌豆Unigene進(jìn)行比對(duì)，鑒定箭筈豌豆中潛在的轉(zhuǎn)錄因子基因。分別通過(guò)MicroSAtellite(MISA, http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)工具和Primer 3軟件進(jìn)行SSR位點(diǎn)識(shí)別和引物設(shè)計(jì)[17]。

表1 箭筈豌豆品種鑒定試驗(yàn)材料Table 1 V. sativa cultivars in the experiment

注：品種類型均為育成品種。

Note: Variety types are cultivar.

1.4 功能注釋

將所獲得的箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄因子中含SSR位點(diǎn)并且能夠成功設(shè)計(jì)引物的Unigene序列，通過(guò)Blast2GO[18]和WEGO軟件進(jìn)行功能注釋[19]。

1.5 PCR擴(kuò)增與檢測(cè)

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。SSR-PCR擴(kuò)增體系為10 μL，在Eppendorf Mastercycler nexus PCR儀(德國(guó))上進(jìn)行：2×Taq PCR MasterMix 5 μL，正反向引物各1 μL (10 μmol·L-1)，模板DNA 1 μL (50 ng·μL-1)，ddH2O 2 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃變性30 s后，62～54 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共8個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s后，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；于4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)人工比對(duì)和軟件校正，對(duì)SSR 標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。按照擴(kuò)增條帶的分子量從大到小編號(hào)讀取，相同遷移位置有帶的記為1，無(wú)帶的記為0，建立“0，1”矩陣，并統(tǒng)計(jì)SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的總條帶數(shù)(total bands, TB)、預(yù)計(jì)雜合度(expected heterozygosity, He)和多態(tài)信息量(polymorphic information content, PIC)[20]。用Quantity One軟件根據(jù)marker分子量計(jì)算特異擴(kuò)增條帶的分子量，通過(guò)Originpro 8軟件把“0，1”數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)模式圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄因子SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

將箭筈豌豆Unigene序列與大豆(Glycinemax)、百脈根(Lotuscorniculatus)和蒺藜苜蓿的轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行本地BLAST比對(duì)，得到34個(gè)潛在的箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄因子家族，共1816個(gè)基因(表 2)。通過(guò)MISA軟件對(duì)Unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)檢測(cè)，其中SSR位點(diǎn)對(duì)應(yīng)重復(fù)的一、二、三、四、五和六核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5、5；同時(shí)，兩個(gè)微衛(wèi)星之間的距離小于100 bp時(shí)，組成一個(gè)復(fù)合微衛(wèi)星。在282個(gè)Unigene中共檢測(cè)到306個(gè)SSR位點(diǎn)，采用Primer 3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，最終208對(duì)SSR引物在188個(gè)Unigene序列中成功設(shè)計(jì)。對(duì)檢測(cè)到的SSR位點(diǎn)的類型和分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表 2)，SSR位點(diǎn)具有三堿基重復(fù)類型的數(shù)量最多，共121個(gè)，占SSR位點(diǎn)重復(fù)類型的58.17%；其次分別為單堿基重復(fù)類型(45，21.63%)、二堿基重復(fù)類型(24，11.54%)，無(wú)四、五和六堿基重復(fù)類型。

表2 箭筈豌豆SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)匯總Table 2 Summary of SSR search results for V. sativa

2.2 含有SSR位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子功能分類

使用Blast2GO和WEGO軟件對(duì)188個(gè)箭筈豌豆Unigene序列進(jìn)行了功能注釋(圖1)。在本研究中，共有156(82.98%)條Unigenes得到了GO注釋，包括細(xì)胞組分(cellular component，110個(gè))，分子功能(molecular function，147個(gè))和生物學(xué)過(guò)程(biological process，117個(gè))，所有的匹配序列被進(jìn)一步富集為28個(gè)功能類別，細(xì)胞組分分類中，細(xì)胞和細(xì)胞成分功能類別中(cell and cell part)均注釋到109個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其次為細(xì)胞器(organelle，102個(gè))?；诜肿庸δ艿姆诸悓⑥D(zhuǎn)錄因子基因分為5組：蛋白結(jié)合(binding，133個(gè))，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性(transcription regulator activity，54個(gè))，催化活性(catalytic activity，13個(gè))，轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity，2個(gè))和結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity，1個(gè))。在生物過(guò)程分類中，兩個(gè)代表性最高的GO術(shù)語(yǔ)是細(xì)胞過(guò)程(cellular process，109個(gè))和代謝過(guò)程(metabolic process，108個(gè))，其次是生物調(diào)節(jié)和生物過(guò)程調(diào)節(jié)(biological regulation and regulation of biological process，均為101個(gè))。

2.3 SSR產(chǎn)物多態(tài)性分析

用208對(duì)成功設(shè)計(jì)的SSR引物對(duì)30份箭筈豌豆品種進(jìn)行遺傳多樣性分析(表3)，共鑒定得到35對(duì)可擴(kuò)增出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好和譜帶清晰的引物(圖2)。每對(duì)引物的擴(kuò)增帶數(shù)從3(VsTFSSR-10、-14、-16和-26)到18(VsTFSSR-24)不等，平均值為8.23。35對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)百分比均達(dá)到了100%；多態(tài)信息含量(PIC)范圍為 0.42(VsTFSSR-26)～1.00(VsTFSSR-01、-05和-08)，平均值為0.80；預(yù)計(jì)雜合度(He)范圍為0.53(VsTFSSR-26)～1.00(VsTFSSR-01、-05和-08)。

圖1 含有SSR位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子GO分類Fig.1 GO classifications of TFs genes containing SSR

引物編號(hào) Primer ID重復(fù)序列 Motif引物序列 Primer sequence (5′-3′)目標(biāo)條帶Product size (bp)總條帶數(shù)Totalbands預(yù)計(jì)雜合度He多態(tài)信息含量 PIC轉(zhuǎn)錄因子家族 Transcription factor familyVsTFSSR-01(ACA)6F:TCAAAACCTTAAACGCTCCGR:GGAACTATTGGATCGGGGTT23081.001.00ERFVsTFSSR-02(CTT)5F:TTCATCAGAACCACCAAAAGCR:CAAAATCCGGCGACTATGTT19440.980.98bHLHVsTFSSR-03(ATC)5F:TCCACCTTCTCTTTCAGATTCTCR:CCGTGAGTTTGATGACGATG27660.990.99G2-likeVsTFSSR-04(CAA)5F:GCAACGCAGAACTCTTTTCCR:TCCGTCTCGAAGCTCTTGTT14540.890.88TCPVsTFSSR-05(TTG)5F:TGGTTGGTAACGAGGGATGTR:CCTCAACAACTCGCCAATCT21391.001.00C2H2VsTFSSR-06(CAA)5F:ATGGCTCATCGTCATCATCAR:TGGTTTTGTGTTTGGGGATT199150.900.89MYBVsTFSSR-07(TGT)5F:TGTTTTCCACATGTTTGTGTCAR:CCACAAATCCACCAAGGTTT156110.850.83TALEVsTFSSR-08(CAT)6F:GAAATCAGTCTTCCAAACAACATR:TGGATTCCAAAGCTCTTTTCC13981.001.00G2-likeVsTFSSR-09(AAC)6F:TCCGAGGTCTGTTCAAAAGGR:ATTTTCCCACCGACACACAT157130.730.69ERFVsTFSSR-10(T)10F:AAAGAGGGTTTACGGTGGCTR:CCAAATCTTTTCTCTCCATTCC21230.890.89ERFVsTFSSR-11(CAT)5F:CCAAACAAACCATCTTTGCATR:AAACCCAAGAACCCCAACTC18240.930.93ERFVsTFSSR-12(GGT)6F:GGTTGAATTCATGCGATGTGR:GATCTATACGGCCGAGCAAC27040.670.61GRAS

續(xù)表3 Continued Table 3

圖2 部分VsTFSSR引物的擴(kuò)增圖譜Fig.2 Amplification results by part of VsTFSSR primers A: VsTFSSR-12; B: VsTFSSR-19; C: VsTFSSR-22; D: VsTFSSR-23; E: VsTFSSR-26; F: VsTFSSR-28; G: VsTFSSR-31.

2.4 箭筈豌豆品種聚類分析

利用NTSYS-pc 2.10軟件的UPGMA法對(duì)30個(gè)箭筈豌豆品種進(jìn)行聚類分析(圖3)，不同品種間的遺傳相似系數(shù)(Nei-Li/Dice系數(shù))范圍為0.69～0.95，表明不同品種之間存在著豐富的遺傳多樣性。首先，30份箭筈豌豆品種被聚為兩大類：國(guó)內(nèi)品種和國(guó)外品種，其中，蘭箭1號(hào)箭筈豌豆在聚類分析中與國(guó)外品種聚為一類，表明蘭箭1號(hào)箭筈豌豆相較于其他國(guó)內(nèi)品種具有更為豐富的遺傳背景。根據(jù)聚類結(jié)構(gòu)進(jìn)一步將30個(gè)箭筈豌豆分為6個(gè)類群，其中A類群有5個(gè)品種，均來(lái)自前蘇聯(lián)；B類群共有5個(gè)品種，3個(gè)品種來(lái)自法國(guó)，1個(gè)來(lái)自美國(guó)，1個(gè)來(lái)自中國(guó)；C類群共有4個(gè)品種，3個(gè)來(lái)自匈牙利，1個(gè)來(lái)自日本；D類群共4個(gè)品種，3個(gè)來(lái)自美國(guó)，1個(gè)來(lái)自匈牙利；E類群共9個(gè)品種，均來(lái)自中國(guó)；F類群共3個(gè)品種，2個(gè)來(lái)自美國(guó)，1個(gè)來(lái)自匈牙利。 聚類分析結(jié)果表明，所選用的35對(duì)SSR引物具有很好的區(qū)分效果，可初步將不同地理起源的品種進(jìn)行區(qū)分。

2.5 VsTFSSR引物鑒定箭筈豌豆品種效率分析

利用35對(duì)引物在30個(gè)箭筈豌豆品種的電泳帶型進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)性分析結(jié)果如圖4所示。引物VsTFSSR-10與VsTFSSR-26、VsTFSSR-14與VsTFSSR-26之間相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)為0.89，表明這兩對(duì)引物間擴(kuò)增帶型差異最小；而VsTFSSR-9與VsTFSSR-24之間相關(guān)性最低，相關(guān)系數(shù)為-0.27，表明擴(kuò)增帶型差異最大。不同引物間的相關(guān)性分析可進(jìn)一步輔助在品種鑒定時(shí)進(jìn)行引物間的優(yōu)化組合，通過(guò)選取相關(guān)性較低的引物組合可以提高引物組合的鑒別效率。例如VsTFSSR-6能夠區(qū)分7個(gè)品種，VsTFSSR-18能夠區(qū)分5個(gè)品種，兩對(duì)引物間的相關(guān)性系數(shù)為0.28，兩對(duì)引物組合可以區(qū)分11個(gè)箭筈豌豆品種。

圖3 30份箭筈豌豆品種VsTFSSR引物聚類分析Fig.3 Dendrogram of 30 V. sativa cultivars based on VsTFSSR primers

圖4 35對(duì)VsTFSSR引物擴(kuò)增結(jié)果相關(guān)性分析Fig.4 The correlation analyzes based on the 35 VsTFSSR primers amplification product 1～35表示引物VsTFSSR-01～VsTFSSR-35。1-35 indicated the primer ID from VsTFSSR-01 to VsTFSSR-35.

2.6 核心引物確定

在篩選出的35對(duì)VsTFSSR多態(tài)性引物中，每個(gè)箭筈豌豆品種至少在1對(duì)VsTFSSR引物中具有特異性條帶，即該品種可以用1對(duì)或1對(duì)以上的引物與其他所有箭筈豌豆品種進(jìn)行區(qū)分(圖5)。例如引物VsTFSSR-24能擴(kuò)增出18個(gè)多態(tài)性條帶，一次性可以區(qū)分19個(gè)品種；VsTFSSR-30擴(kuò)增出13個(gè)多態(tài)性條帶，一次性可以區(qū)分15個(gè)品種；VsTFSSR-35擴(kuò)增出15個(gè)多態(tài)性條帶，一次性可以區(qū)分12個(gè)品種。通過(guò)對(duì)引物擴(kuò)增的特異性條帶數(shù)和不同引物間的相關(guān)性進(jìn)行分析，確定利用6對(duì)引物(VsTFSSR-21、VsTFSSR-23、VsTFSSR-24、VsTFSSR-30、VsTFSSR-34和VsTFSSR-35)就可將所有的30個(gè)箭筈豌豆品種區(qū)分開(kāi)，這6對(duì)引物可作為箭筈豌豆品種指紋圖譜構(gòu)建的核心引物。以篩選出的6對(duì)核心引物擴(kuò)增電泳圖譜為基礎(chǔ)，由 1和 0 組成的字串構(gòu)成數(shù)字指紋，再經(jīng)Originpro 8軟件轉(zhuǎn)換，建立了基于6對(duì)引物擴(kuò)增的蘭箭1號(hào)、蘭箭2號(hào)和蘭箭3號(hào)品種標(biāo)準(zhǔn)模式圖(圖6)。根據(jù)每個(gè)品種的特異性帶型，可以比較容易地鑒定區(qū)分，如VsTFSSR-24、VsTFSSR-30和VsTFSSR-35中的一對(duì)引物就可以將上述3個(gè)品種完全區(qū)分開(kāi)。

圖5 30個(gè)箭筈豌豆品種特異性識(shí)別引物數(shù)量Fig.5 The number of the VsTFSSR primers specifically identified in 30 V. sativa cultivars

圖6 基于6對(duì)核心引物擴(kuò)增的3個(gè)箭筈豌豆品種指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)模式圖Fig.6 Mode image of fingerprintings for three V. sativa cultivars by six core primer pairsA: 蘭箭1號(hào) Lanjian1; B: 蘭箭2號(hào) Lanjian2; C: 蘭箭3號(hào) Lanjian3.

2.7 箭筈豌豆品種指紋圖譜構(gòu)建

統(tǒng)計(jì)6對(duì)核心引物在30個(gè)箭筈豌豆中擴(kuò)增的1，0數(shù)據(jù)，將6對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果組合在一起即為箭筈豌豆的DNA指紋圖譜。如用6對(duì)SSR引物擴(kuò)增TYESISSKAYA品種，在6對(duì)引物中得到的圖譜分別為0000100、00000000100、000000000000000010、0100010000010、000001000和000000011001000，將其組合到一起為0000100-00000000100-000000000000000010-0100010000010-000001000-000000011001000(表 4)，得到由“0”和“1” 組成的73個(gè)數(shù)字圖譜。利用組合的數(shù)字圖譜構(gòu)成了30個(gè)箭筈豌豆品種的組合指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，當(dāng)30條字符串形成能夠唯一標(biāo)識(shí)的字符串時(shí)，即表明這6對(duì)VsTFSSR引物能將30份箭筈豌豆品種全部區(qū)分開(kāi)，每一條字符串可以作為每一份箭筈豌豆的分子身份證號(hào)碼。

表4 30個(gè)箭筈豌豆品種的DNA指紋圖譜Table 4 DNA fingerprint of the 30 V. sativa cultivars

3 討論

相比其他類型的分子標(biāo)記，SSR分子標(biāo)記以其獨(dú)特優(yōu)越性，從2005年起就被國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)推薦作為建庫(kù)優(yōu)選的標(biāo)記，因此在品種鑒定上具有較高的權(quán)威性[21-22]。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已被廣泛用于研究模式和非模式植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)逆境脅迫響應(yīng)的機(jī)制研究[23-24]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的 SSR 標(biāo)記具有 EST-SSR 標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還可以提高植物遺傳多樣性分析的準(zhǔn)確性。相對(duì)于其他豆科牧草，如苜蓿(Medicagosativa)、三葉草(Trifolium)、百脈根和草木樨(Melilotussuaveolens)等，目前對(duì)箭筈豌豆遺傳結(jié)構(gòu)及群體多樣性的研究相對(duì)較少，分子標(biāo)記數(shù)量十分有限，遠(yuǎn)不能滿足箭筈豌豆遺傳多樣性研究與分子育種工作的需要。同時(shí)，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法具有耗時(shí)長(zhǎng)、需要專門(mén)的技術(shù)人員、易受環(huán)境條件限制、需要大量的土地面積等缺點(diǎn)。目前以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)已被成功地運(yùn)用于水稻(Oryzasativa)、茶樹(shù)(Camelliasinensis)、苜蓿和棉花(Gossypiumspp.)等植物的品種鑒定中[25-28]。

本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)鑒定了箭筈豌豆 Unigene序列中潛在的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而檢測(cè)了轉(zhuǎn)錄因子序列中的SSR位點(diǎn)，利用Primer 3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，成功獲得208對(duì)轉(zhuǎn)錄因子SSR引物，最終從208對(duì)SSR引物中篩選獲得35對(duì)條帶清楚、擴(kuò)增效果穩(wěn)定的多態(tài)性引物。研究表明當(dāng)PIC值大于0.5可作為信息標(biāo)記，當(dāng)PIC值大于0.7可用于構(gòu)建遺傳圖譜[29]。在本研究中，35對(duì)SSR引物的PIC平均值為0.80，除VsTFSSR-26(PIC=0.42)引物的PIC值小于0.5，其余引物的PIC值均大于0.5；其中27個(gè)(77.14%)引物的PIC值大于0.7，表明基于轉(zhuǎn)錄因子開(kāi)發(fā)的多態(tài)性分子標(biāo)記在箭筈豌豆遺傳多樣性和遺傳圖譜分析中具有較大的潛力。Kim等[30]對(duì)兩個(gè)箭筈豌豆亞種(V.sativassp.sativa和V.sativassp.nigra)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，在兩個(gè)亞種中分別選取100對(duì)引物，并分別在9個(gè)V.sativassp.sativa和 9個(gè)V.sativassp.nigra亞種中對(duì)開(kāi)發(fā)的標(biāo)記進(jìn)行評(píng)價(jià)，PIC值為0.38～0.75，在兩個(gè)箭筈豌豆亞種中的平均PIC值分別為0.54 (sativa)和0.51 (nigra)；Chung等[31]利用高通量測(cè)序在箭筈豌豆中獲得17971條序列，從中鑒定得到2429個(gè)SSR位點(diǎn)，共設(shè)計(jì)并合成了100對(duì)cDNA-SSR引物。在32份箭筈豌豆材料中篩選出49對(duì)多態(tài)性引物，PIC的范圍為0.20～0.86，平均值為0.59；Liu 等[32]用96對(duì)EST-SSR引物在10個(gè)箭筈豌豆材料中進(jìn)行擴(kuò)增，PIC的范圍為-0.09～0.98，平均值為0.70；Liu等[6]在44個(gè)苜蓿品種中評(píng)估了27個(gè)多態(tài)性TFGM(transcription factor gene-derived microsatellite)分子標(biāo)記，PIC值為0.08～0.84，平均值為0.60。而本研究篩選出的35對(duì)VsTFSSR引物在30個(gè)箭筈豌豆品種中的PIC平均值為0.80，均高于以上研究結(jié)果，表明VsTFSSR標(biāo)記在箭筈豌豆遺傳多樣性分析中優(yōu)于其他類型的SSR標(biāo)記。

對(duì)引物擴(kuò)增的特異性條帶數(shù)和不同引物間的相關(guān)性進(jìn)行分析，確定了6對(duì)核心引物用于構(gòu)建30個(gè)箭筈豌豆品種的DNA指紋圖譜。把6對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果組合在一起就可以將30個(gè)箭筈豌豆品種完全區(qū)分開(kāi)，即每個(gè)箭筈豌豆品種都有能夠唯一標(biāo)識(shí)的一份品種字符串。目前UPOV已為箭筈豌豆制定了DUS測(cè)試指南，國(guó)內(nèi)箭筈豌豆的DUS測(cè)試指南正在研制中，因此箭筈豌豆SSR引物的開(kāi)發(fā)和指紋圖譜的構(gòu)建可以為SSR標(biāo)記技術(shù)在箭筈豌豆DUS測(cè)試中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，在箭筈豌豆品種鑒定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等方面發(fā)揮積極作用，同時(shí)在育種策略調(diào)整和選配優(yōu)良雜交組合培育新品種等方面具有現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

本研究利用箭筈豌豆 Unigene序列鑒定潛在的轉(zhuǎn)錄因子基因，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)SSR引物；并從中篩選獲得35對(duì)多態(tài)性引物，證明基于箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定其轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的可行性。最終用6對(duì)核心引物構(gòu)建了30個(gè)箭筈豌豆品種的DNA指紋圖譜。本研究可以從分子水平快速準(zhǔn)確鑒別和了解箭筈豌豆品種的遺傳差異，進(jìn)而為合理利用箭筈豌豆種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。