劉淑娟，張曉軍，李欣，劉成，白建榮，任永康，鄭軍，李世姣，郭慧娟，梅超，張樹偉，暢志堅(jiān)*，喬麟軼*

(1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030031；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟(jì)南 250100； 4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西 臨汾 041000)

中間偃麥草(Thinopyrumintermedium，2n=6x=42，JJJsJsStSt)是禾本科小麥族偃麥草屬的多年生異花授粉植物，具有長勢(shì)茂盛、適應(yīng)性廣、莖葉富含蛋白等特性，在世界各地被作為優(yōu)良牧草而廣泛栽培，同時(shí)也是防風(fēng)固沙、保持水土和改良鹽堿地的理想物種[1]。中間偃麥草屬于部分異源-同源六倍體，其進(jìn)化過程和染色體組成較為復(fù)雜。自1936年起，研究人員先后提出了 AXY[2]、BEF[3]、E1E2X[4-5]和B2X1X2[6]等染色體結(jié)構(gòu)，目前普遍認(rèn)為其組成應(yīng)為JJsSt，其中 J 來自百薩偃麥草(Th.bessarabicum，2n=2x=14，JbJb)和二倍體長穗偃麥草(Th.elongatum，2n=2x=14，JeJe)，St 來自擬鵝觀草(Pseudoroegneiriastrigosa，2n=2x=14，StSt)，Js則是與St發(fā)生部分重組的J染色體組[7-12]。

由于中間偃麥草與普通小麥(Triticumaestivum，2n=6x=42，AABBDD)同為六倍體，容易與之雜交成功，且因其抗逆性強(qiáng)，尤其對(duì)小麥白粉病、銹病、黃矮病、黑穗病等主要病害均表現(xiàn)出優(yōu)良的抗性[1,13-22]，因此成為小麥遺傳改良的重要野生資源之一。目前國內(nèi)外已將中間偃麥草諸多優(yōu)良抗性導(dǎo)入小麥，并利用細(xì)胞學(xué)技術(shù)鑒定出一大批小麥-中間偃麥草附加系、代換系和易位系[14-22]，其中，中間偃麥草第6同源群已被證實(shí)對(duì)小麥白粉病和條銹病免疫[16-17]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記也被用于鑒定雜交材料中的外源染色體片段。Qi 等[21]利用1個(gè) SSR 標(biāo)記和3個(gè) EST 標(biāo)記鑒定出小麥抗白粉病材料 SN100109中附加了1對(duì)中間偃麥草2J 染色體；Salina等[17]利用9個(gè) SSR 標(biāo)記鑒定出小麥品系Tulaikovskaya的6D 染色體被同源的中間偃麥草6號(hào)染色體代換從而獲得了抗病性；Li 等[22]利用42個(gè) PLUG 標(biāo)記鑒定出4個(gè)小麥-中間偃麥草附加系、代換系和易位系。然而由于中間偃麥草基因組尚未完成測(cè)序，而現(xiàn)有的中間偃麥草特異分子標(biāo)記很大部分來自小麥等物種[15-22]，或者是基于中間偃麥草某條染色體或染色體區(qū)段而開發(fā)的若干標(biāo)記[23]，遠(yuǎn)不能滿足鑒定需要。為此，本研究對(duì)近期公布的中間偃麥草 GBS(genotyping-by-sequencing)芯片探針序列[24]進(jìn)行組裝和過濾，據(jù)此開發(fā)了一套分子標(biāo)記，并對(duì)第6同源群的標(biāo)記進(jìn)行了篩選驗(yàn)證，以期為中間偃麥草染色體的鑒定提供較為經(jīng)濟(jì)和便捷的工具。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中間偃麥草 Z1141、百薩偃麥草、擬鵝觀草、普通小麥農(nóng)家品種中國春、蘭花麥、白秋麥、小白芒、江西早由作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；二倍體長穗偃麥草以及中國春-二倍體長穗偃麥草代換系6Je/6A、6Je/6B 和6Je/6D 由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)馬建副研究員和山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉成副研究員惠贈(zèng)；小麥-偃麥草代換系材料 F881(6St/6D)由電子科技大學(xué)楊足君教授惠贈(zèng)。試驗(yàn)時(shí)間為2018年3-10月。

1.2 序列組裝及過濾

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)下載中間偃麥草 GBS 芯片探針數(shù)據(jù)(注冊(cè)號(hào)SRX3008333)，使用 SOAPdenovo 軟件將其組裝為 Contig 序列，并去除冗余，將所獲序列與小麥中國春基因組(IWGSCv1.0，https://urgi.versailles.inra.fr/)進(jìn)行比對(duì)，去除相似性大于80%的序列。

1.3 分子標(biāo)記開發(fā)

對(duì)中間偃麥草Contig序列開發(fā)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence-tagged site，STS)分子標(biāo)記，用于分析擴(kuò)增產(chǎn)物的有無或長短。設(shè)計(jì)引物所用的 Perl-primer 腳本程序由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院王長彪副研究員惠贈(zèng)，參數(shù)設(shè)置為：引物長度20 bp，產(chǎn)物長度范圍100～400 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 DNA提取及標(biāo)記驗(yàn)證

將試驗(yàn)材料在培養(yǎng)皿中發(fā)苗，待生長至3葉期剪取葉片。采用 CTAB 法提取材料葉片的基因組總 DNA。PCR 反應(yīng)總體系為10 μL：1.5 μL DNA(50 ng·μL-1), 1.0 μL Primers(50 ng·μL-1), 5.0 μL Taq PCR Mix 預(yù)混液，2.5 μL ddH2O。反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 25 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=29∶1)中電泳后用0.1%硝酸銀染色顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 中間偃麥草序列組裝及標(biāo)記開發(fā)

利用下載的中間偃麥草 GBS 探針序列(每條60 bp)共組裝出5877409條 Contig，長度范圍為100～3094 bp，總堿基數(shù)915311073 bp(表1)。通過信息學(xué)分析，篩選出具有染色體同源群定位信息[24]的非冗余 Contig 序列5452條，在中間偃麥草第1至第7同源群分布數(shù)目依次為704、686、877、656、893、624、1012條(圖1)。

對(duì)篩選出的5452條中間偃麥草 Contig 設(shè)計(jì)引物，共開發(fā)標(biāo)記2019個(gè)，在第1至第7同源群分布數(shù)目依次為250、215、323、253、323、253和402個(gè)(圖1)。

表1 中間偃麥草GBS探針序列組裝結(jié)果Table 1 Sequence assembly for GBS probes of Th. intermedium

2.2 第6同源群標(biāo)記篩選

圖1 中間偃麥草Contig序列和開發(fā)標(biāo)記分布Fig.1 Distribution of Contigs and developed markers in Th. intermedium

利用5株中間偃麥草和5個(gè)小麥農(nóng)家種的 DNA 對(duì)中間偃麥草第6同源群的253個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，共有160個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出差異條帶(表2，圖2)，分布在同源群內(nèi)的 Group6 (G6)-Chr1、G6-Chr2和G6-Chr3染色體，分別有58、59和43個(gè)，其中只在中間偃麥草中具有擴(kuò)增產(chǎn)物的“+/-”型特異標(biāo)記共有53個(gè)，依次為32(G6-Chr1)、13(G6-Chr2)和8(G6-Chr3)個(gè)。

2.3 G6特異標(biāo)記所在基因組分析

利用中間偃麥草祖先種和6Je代換系對(duì)160個(gè) G6特異標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示 G6-Chr2上59個(gè)標(biāo)記中有11個(gè)標(biāo)記在祖先種中無擴(kuò)增或無相同條帶，剩余標(biāo)記在 Je基因組(二倍體長穗偃麥草、代換系 6Je/6A、6Je/6B 和6Je/6D)、Jb基因組(百薩偃麥草)和 St 基因組(擬鵝觀草)有特異性擴(kuò)增條帶的數(shù)目依次為1、5和34，其中 St 特異標(biāo)記占85%(圖2b，圖3)，因此推斷 G6-Chr2為中間偃麥草6St 染色體；而 G6-Chr1和 G6-Chr3上的 Je/Jb/St 基因組特異標(biāo)記數(shù)目分別為10/1/18和6/4/11，暫不能確定其染色體組成。

2.4 Thi-6St特異標(biāo)記用于材料驗(yàn)證

選擇6St(G6-Chr2)染色體上的13個(gè)“+/-”型特異標(biāo)記對(duì)代換系材料 F881(6St/6D)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。這些標(biāo)記在中間偃麥草中都能擴(kuò)增出條帶，在 F881中能擴(kuò)出11個(gè)(85%)，在中國春中則無擴(kuò)增(圖4)，該結(jié)果可從分子水平上驗(yàn)證代換系材料 F881中導(dǎo)入了6St 染色體，證實(shí)了Thi-6St 特異標(biāo)記用于外源鑒定的可行性。

表2 中間偃麥草第6同源群部分特異分子標(biāo)記Table 2 Parts of specific molecular markers in the sixth homo-group of Th. intermedium

圖2 第6同源群特異標(biāo)記G6-Chr1-107(a)、G6-Chr2-72(b)、G6-Chr3-128(c)的鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of Thi-G6 specific markers G6-Chr1-107(a), G6-Chr2-72(b) and G6-Chr3-128(c) M: 指示帶；1～5：中間偃麥草 Z1141-1～5；6～10：普通小麥農(nóng)家種蘭花麥、白秋麥、小白芒、江西早和中國春；11：百薩偃麥草；12：二倍體長穗偃麥草；13：擬鵝觀草；14～16：中國春-二倍體長穗偃麥草代換系6Je/6A、6Je/6B和6Je/6D。箭頭指示多態(tài)性條帶。M: Marker ladder; 1-5: Th. intermedium Z1141-1～5; 6-10: Wheat landraces Lanhua, Baiqiu, Xiaobaimang, Jiangxizao and Chinese spring; 11: Th. bessarabicum; 12: Th. elongatum; 13: Ps. strigosa; 14-16: Chinese spring-Th. elongatum substitution line 6Je/6A, 6Je/6B and 6Je/6D. Arrows show polymorphic bands.

圖3 第6同源群特異標(biāo)記在Je/Jb/St基因組中的擴(kuò)增Fig.3 Amplification of Thi-G6 specific markers in Je/Jb/St genomes圖形顏色的深淺代表數(shù)目的多少。 The shade of the color of the Wayne diagram represents the number.

圖4 “+/-”型Thi-6St特異標(biāo)記在中間偃麥草Z1141(a)、小麥-偃麥草代換系F881(b)和中國春(c)中的擴(kuò)增Fig.4 Amplification of “+/-” type Thi-6St specific markers in Th. intermedium Z1141 (a), wheat-Thinopyrum substitution line F881 (b) and Chinese spring (c) M: 指示帶Marker ladder；6St-7～6St-150：中間偃麥草6St染色體“+/-”型特異標(biāo)記 “+/-” type specific markers on Thi-6St.

3 討論

自前蘇聯(lián)科學(xué)家Tsitsin[25]通過遠(yuǎn)源雜交首次獲得小麥-中間偃麥草八倍體以來，利用附加系、代換系、易位系等材料將中間偃麥草的抗逆、優(yōu)質(zhì)等諸多農(nóng)藝性狀導(dǎo)入小麥，極大促進(jìn)了小麥品種的遺傳改良。在對(duì)遠(yuǎn)源雜交后代外源染色體的追蹤過程中，原位雜交技術(shù)是最為直觀和最有說服力的鑒定手段，但是其鑒定結(jié)果還不能精確到染色體具體位置，此外對(duì)于高代材料中的外源小片段、特別是對(duì)于隱性滲入系[26-27]尚無法鑒別，因此需要分子標(biāo)記的輔助鑒定。

本研究基于組裝出的中間偃麥草基因組序列開發(fā)了一套STS標(biāo)記，并從第6同源群上的253個(gè)標(biāo)記中篩選出107個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，即因中間偃麥草和普通小麥基因組序列的部分同源性而擴(kuò)增出不同長度產(chǎn)物的特異標(biāo)記，該比例(42%)與利用小麥第6同源群SSR標(biāo)記來驗(yàn)證小麥-中間偃麥草間多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(41%)一致[28]；另外本研究還篩選出53個(gè)只在中間偃麥草中有擴(kuò)增產(chǎn)物的“+/-”型特異標(biāo)記，豐富了鑒定標(biāo)記的數(shù)量。分析這些特異標(biāo)記所在染色體的基因組組成發(fā)現(xiàn)，G6-Chr2特異標(biāo)記在擬鵝觀草中的特異性最高，因此最容易鑒定出其為6St；G6-Chr1上的標(biāo)記在Je+Jb中特異的共有11個(gè)，在擬鵝觀草中特異的有18個(gè)，占62%，而 G6-Chr3上的標(biāo)記在擬鵝觀草中特異的占52%，兩者無明顯差異，因此尚不能確定 G6-Chr1和 G6-Chr3的染色體組成，今后需使用中間偃麥草6Js或6J 在小麥中的附加系、代換系材料加以鑒定。6Js與6J 不易區(qū)分可能是由于中間偃麥草 Js染色體組與 J 染色體組非常相近，只在其染色體著絲粒區(qū)域包含部分 St 染色質(zhì)[7]所致，此外，Thi-G6特異標(biāo)記中還有43個(gè)(27%)未能在任何一個(gè)祖先種中擴(kuò)增出特異條帶，意味著中間偃麥草在由祖先種自然雜交形成多倍體后，其基因組經(jīng)歷了較深層次的重組，逐漸向新物種的方向演化，這個(gè)現(xiàn)象在自然界普遍存在[29]。

由于 J 組和 St 組是兩個(gè)麥族基礎(chǔ)基因組[13,30]，因此，中間偃麥草特異標(biāo)記還可以用于鑒定含有 J 或 St染色體的其他麥族物種。利用53個(gè)“+/-”型Thi-G6特異標(biāo)記對(duì)一份小麥和長穗偃麥草(2n=10x=70，JJJJJJJsJsJxJx)的代換系材料 X005(6Js/6B)[31]進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示 G6-Chr1-46、70、107和181等9個(gè)標(biāo)記可以鑒定出 X005中的外源染色體6Js。本研究下一步將對(duì)其余6個(gè)同源群的分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，開發(fā)整套中間偃麥草特異標(biāo)記，這將為中間偃麥草甚至其他麥族近緣物種的鑒定提供較為快速和經(jīng)濟(jì)的分子檢測(cè)手段，這些標(biāo)記既可用于麥族物種的分類和進(jìn)化研究，也可用于小麥育種工作中的遺傳背景改良。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于組裝的中間偃麥草序列共開發(fā)2019對(duì)STS標(biāo)記，其中第6同源群有253對(duì)，經(jīng)過篩選獲得160對(duì)特異標(biāo)記，包含58個(gè)G6-Chr1標(biāo)記、59個(gè)G6-Chr2標(biāo)記和43個(gè)G6-Chr3標(biāo)記。其中G6-Chr2為6St染色體，利用6St上的13個(gè)“+/-”型特異標(biāo)記，可驗(yàn)證小麥-偃麥草代換系材料F881中導(dǎo)入的外源6St染色體。